【毕业学位论文】（Word原稿）固氮斯氏假单胞菌A1501亚硝酸还原酶编码基因nirS的研究微生物学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 固氮斯氏假单胞菌 硝酸还原酶编码基因 研究 1501 1501 缩 略 词 缩略词 英文名称 中文名称 p m 1501 氮斯氏假单胞菌 炔还原活性 邻硝基 氨卞青霉素 四环素 卡那霉素 氯霉素 bp 基对 血清白蛋白 代十六烷基三甲胺 氧核糖核苷酸 EB 化乙锭 丙基硫代 kb 碱基对 养基 钟 合酶链式反应 分钟转速 二烷基磺酸钠 4 3 i 摘 要 微生物的反硝化作用是自然界氮素循环的重要环节。固氮斯氏假单胞菌（ 离自中国南方的水稻根际，在浸水条件氧分压很低时，具有较强的反硝化能力。本论文开展了该菌 反硝化作用 的 生理生化和分子生物学研究，为降低联合固氮菌的反硝化效率奠定理论基础。 本研究 克隆了反硝化过程中的关键酶编码基因亚硝酸还原酶基因 构建了携带因盒的自杀性重组 质 粒 用三亲接合方法将重组质粒入野生型菌株 ，通过同源交换获得了 变株 以 硝酸盐为电子受体的条件下， 该突变 株与野生型比较 ，突变株 反硝化能力明显降低。以亚硝酸盐为电子受体的条件下，野生型 10 小时内能将培养基中的一定浓度的亚硝酸盐完全消耗，而 0左右，推测在 可能存在着另一条代谢活性较低、不依赖于亚硝酸还原酶 亚硝酸利用途径。 通过设计特异性引物，采用 法克隆了 硝酸还 原酶基因 编码基因 启动子区，将其与载体 接获得重组 表达载体 用两亲接合试验方法，将 移入野生型 变株中。 定 结果表明： 表达受氧的抑制，在厌氧条件下的表达活性明显高于好氧条件。 在厌氧条件下 在不同 亚硝酸盐浓度条件下 表达活性 较低，最高为 2600 活性变化幅度较小 ； 而硝酸盐能 诱导其表达，在 硝酸盐 浓度为 1 时，表达活性最高，达 12900 硝酸盐 浓度较低（ 0.1 ）或较高 （ 10 ）时，表达活性约为 3500 在厌氧条件下以硝酸盐为电子受体时， 变株中的表达水平远远低于野生型，表达活性仅为野生型的四分之一左右，表明 因启动子为 54 因子依赖型。由于 在 因启动区中未发现典型的 54因子识别序列，推测 因启动区 可能存在非典型的 54 因子识别结构。 本论文开展了突变株在水稻根表定殖能力的初步研究。 关键词： 斯氏假单胞菌 反硝化， 因，固氮活性，定殖 by is an of 1501 in is in to of In we on 1501. of to a of 1501 by 3) by of km by in 1501 as as 1501 0 in be 1501, 0% It is 1501. By CR it of to a 1501by of by of 600 of by in 2900 In of 10 ) or 0.1 ), is 500 as of in in in It a 54no 54 in so it 54 in on of of 1501 ， 录 摘 要 . i . 一章 引 言 . 1 1. 反硝化作用在氮素循环中的意义 . 1 2. 反硝化作用概述 . 2 3. 反硝化细菌的分布及特点 . 4 4. 反硝化细菌中亚硝酸盐还原酶的研究进展 . 5 5. 本工作立题依据及研究思路 . 9 第二章 亚硝酸盐还原酶编码基因突变菌株的构建 . 11 1 实验材料 . 11 株和质粒 . 11 养基 . 12 生素 . 12 物化学试剂、酶及试剂盒 . 13 物 . 13 液的配制 . 14 验仪器 . 14 2实验方法 . 14 因组 分离 . 14 裂解法小量提取细菌质粒 . 15 菌总 提取 . 16 增 . 16 物的纯化 . 17 切及连接反应 (et 1989) . 17 受态细胞的制备及连接产物的转化 . 18 粒的接合转移 . 18 株固氮活性测定 . 19 蛋白的测定 . 20 硝化能力的测定 . 20 3结果与分析 . 21 1501 中亚硝酸盐还原酶为 . 21 1501 的反硝化作用及影响因子 . 22 硝酸还原酶编码基因突变菌株的构建 . 25 变株 理化性质测定 . 28 4讨论 . 30 第三章 株 因表达调控的研究 . 31 1 实验材料 . 31 株和质粒 . 31 、试剂和试剂盒 . 31 物 . 31 . 32 2 实验方法 . 32 粒载体的制备： . 32 段的回收 . 33 物片段的克隆 . 33 切及连接反应 . 33 击转化法感受态细胞的制备、转化 . 34 性的测定 . 34 3 结果和分析 . 35 3.1 因表达载体构建 . 35 3.2 因表达载体转入 . 38 氏假单胞菌 因的表达调节 . 38 3.4 达载体转入 变菌株 . 40 4. 讨论 . 41 第四章 结 论 . 42 附录 1 突变株和野生菌株定殖能力的初步研究 . 43 1 实验材料 . 43 株 . 43 养基 . 43 剂 . 44 剂 . 44 2实验方法 . 44 稻根表定植试验 . 44 植的显微镜检测 . 44 描电镜观察 . 45 3结果和分析 . 46 变株根表定殖的平板记数 . 46 变株在水稻根表的定殖及扫描电镜观察 . 47 附录 2 . 49 附录 3 . 51 参考文献 . 53 致 谢 . 60 中国农业科学院硕士学位论文 引言 1 第一章 引 言 1. 反硝化作用在氮素循环中的意义 氮素循环由以下几部分构成：生物固氮作用，铵化作用，硝化作用，反硝化作用，氮素的同化作用（图 1G， 1998）。各种氮素形态间的相互转化主要是由生物反应所致 ( ,2001； P， 2002)。从图中可以看出，这些氮素形态的转化步步相连，一步都不可缺失。没有生物的固氮作用就没有化合态氮的产生。当地球上存留的少量化合态氮被反硝化作用转变为氮气后地球上可利用的氮素将最终消失。可以说是生物的固氮作用使得氮素活跃起来。但固氮作用只能将分子态氮“活化”为化合态氮 铵根，若没有后续的铵根形态的转化步骤，铵根就会大量的聚集，而众所周知，高浓度的铵根对生物是有毒害的。另外，铵根的特点决定了它不能迅速转移，因为它与土壤颗粒等容易紧密吸附，所以仅有固氮作用还不能使氮素充分地在地球上“流动”起来；此时亚硝化、硝化细菌的出现使得铵根可以转变为硝酸根，这样氮素就变得更易于流动，硝 态氮的流动特性使得它可以渗入地下，进入河流，通过水网进入海洋。但若所有经过固氮作用、硝化作用形成的硝态氮不再有另外形式的转化，那么这些氮素就会经水网进入到海洋，并在海洋永久地富集起来。这种单向的行为一直进行下去的后果就是全球的氮素包括分子态氮都会全部转化为硝态氮而汇入海洋。反硝化作用的重要生态作用就在于将硝态氮重新转化为分子态氮，缓解硝态氮的累积，完成氮素循环。反硝化作用发生在自然环境中的各个生态区域。在陆地的森林、农田 ； 在水域的河流、湖泊、水库、海洋等都有反硝化作用的发生（ 1989； 975）。 自然界中反硝化作用是氮素重新返回大气的主要途径 ( 人类大规模开展合成氨工业之后，自然界的氮素平衡被破坏。大量地使用化肥的农业形成大面积的氮素污染，图 1氮素循环示意 1 生 菌 物 分 吸 解 收 电 铵化作用 动物食物 同化作用 亚硝化作用 硝化作用 闪地 固 氮 铵化作用 反 反 硝 硝 化 化 植物 /微生物蛋白 动物蛋白 尿 素 泄粪便 中国农业科学院硕士学位论文 引言 2 这些化合态氮素进入到流动的水域或进入地下水，又通过这些水体的运动使得周边的湖泊、海洋受到氮素的污染。大量外源氮素沉积于湖泊底泥和海洋入口的沿岸带沉积物中。当氮素含量超过一定的限度，通过自然发生的氮素循环已经无法有效地将这些过量的氮素及时转变为氮气，因此人为的将化合态氮转变为分子 态氮即对反硝化作用的研究引起了人类的关注，以工程手段强化反硝化作用是人类平衡氮素循环，控制氮素污染的伟大创举。 我国对稻田表施 15N 标记硫酸铵的氮素平衡测定结果表明，平衡帐中的亏缺部分可达施入 155左右，推测主要是反硝化损失的结果。朱兆良等应用氮素平衡帐扣除 发量的方法，间接测定氮素反硝化损失量。其结果在太湖地区酸性粘质水稻土上，碳铵、尿素作水稻基肥与土混施时的硝化 反硝化损失分别达 39和 37。故深入研究反硝化作用对农业减少氮素流失具有积极的效果。 作为反硝化作用的电子受体的 硝酸盐和亚硝酸盐，它们之所以受到公共卫生部门的高度重视，是因为它们可以诱发高铁血红蛋白血症（ 胃癌。高铁血红蛋白血症主要发生于婴儿人群中，患者皮肤呈现淡蓝色，也叫“蓝儿”症。鉴于此，饮用水标准规定，硝酸盐含量必须低于 10。 2. 反硝化作用概述 反硝化作用的实质是一个硝酸盐的生物还原过程。硝酸盐还原作用有三种形式（郑平， 2003）： 同化性的硝酸盐还原作用 .、 铵化作用及反硝化作用（后两者合起来也叫异化性硝酸盐还原作用）。同化性的硝酸盐还原中，产物被用于合成细胞物 质。而异化性硝酸盐还原作用（产物为氨或氮气）不供菌体合成自身物质。 微生物是否具有反硝化作用，可用 1988 年 出的反硝化作用的标准（ 1988）进行判定： （ 1） 对氧抑制作用具有敏感性； （ 2） 生长量与供给的氧化氮量呈比例； （ 3） 培养基中 80或更多可利用的 或 累积成 N 2O 或 （ 4） 无 累积， 或 将快速被消耗； 反硝化势（ 反硝化酶活性 (是测定反硝化作用时常要用到的两个概念，通过它们可以来衡量微生物和包含反硝化微生物的环境如土壤、水域、底泥等的反硝化的能力。反硝化势（ 1992）是指在外加硝酸的情况下，反硝化微生物（或含有反硝化微生物的样品）在一定时间内产生的反硝化产物 ( 多少。用来衡量进行反硝化作用的潜在能力。在培养过程中不抑制微生物的正常生长。反硝化酶活性（ 1979）是加入氯霉素来抑制微生物的生长但在短时间内不抑制微生物的反硝化酶活，通过测定反硝化产 物的生成衡量反硝化作用的大小。反硝化势和反硝化酶活性在方法上的主要区别在于时间的长短。 定一般时间较长，可以测定数小时到几十个小时内反硝化产物的生成。测定的结果可以表示该样品中反硝化微生物在长时间培养过程中利用反硝化作用呼吸、繁殖的能力。这就需要添加较多的碳源来维持硝酸的还原。而 定则仅在数个小时内进行，测定的主要目的是样品现在状态下的反硝化能力，不需要添加太多碳源。 由于反硝化的终产物或中间产物不供菌体合成自身物质，从而造成氮素在该系统内的净损中国农业科学院硕士学位论文 引言 3 失。 反硝化损失的研究方法主要由 15N 平衡差值法、乙炔 抑制法和 15N 示踪 气体直接法。 15 将施入土壤的 15555N 量之差，作为硝化反硝化损失量，也称为表观反硝化损失量。其优点是 15N 丰度和氨挥发可以准确测定，在不存在淋洗和径流损失时结果可靠。缺点是施入的 15N 肥料与原有的氮素之间的生物交换作用，使测得的总损失量偏低。 乙炔抑制法 利用乙炔抑制 2，通过测定 简单直接、检测、灵敏度高，可用于土壤等非标记的反硝化损失量的测定，尤其适合 旱地土壤。 15N 示踪 气体直接法 该法是施用高丰度 15N 标记的肥料，定时采集土壤放出的含有（ 2） 体样品，经前处理以后直接在高精度的质谱仪上测定。该法灵敏度高，采气样时不破坏土壤与植物。李新慧等建立了进样系统，采用减压采气技术有效促进反硝化气体的逸出。 我国对反硝化的研究起步较晚， 50 年代用定性或半定量的方法，测定了土壤中反硝化细菌的数量。 60 年代初我国学者阐明了亚硝酸细菌在嫌气条件下可进行亚硝化作用（陈华癸、周启 . 1963）。提出了水稻土中亚硝化细菌属兼嫌气性类群，反硝化细菌与之伴 生而导致氮损失。阮妙增等 1964 年初步证明，水稻田中氮素反硝化损失的关键原因之一是氧化层中的硝化作用。杨国治等用全氮回收法研究了水稻土脱氮的土壤条件。此后相当一个时期由于研究方法存在困难，反硝化作用的研究处于停滞制阶段。 80 年代中后期，由于气相色谱仪的普及和方法的逐步掌握，张福珠（ 1985）、金芳（ 1988）和江德爱等（ 1989）先后在实验室条件下研究反硝化过程产生的 贵信等（ 1991）用高丰度 15N 示踪和电弧探索直接测定水稻田中反硝化的损失量。苏维瀚等（ 1992）用密闭体系直接收集和检 测施用尿素的麦地中释放的 量。 土壤的反硝化作用是反硝化微生物在多种因素影响下的综合表现。碳源种类、根系、耕作方式、土壤类型、利用方式等对反硝化作用都有影响。对此李良谟等人 (1989)进行了研究并得到以下的结论：第一、碳源数量限制反硝化作用。有机碳含量较少的石灰性水稻土中的反硝化势弱，添加葡萄糖后土壤的反硝化势则明显增加；根系分泌物多的植物，其反硝化势要比分泌少的植物反硝化势高。第二、不同种类的植物根系，其反硝化势不相同。并试验证明不同种类的植物根际和根圈其主导微生物不相同：水稻根表面以铜绿假单胞菌为 主，根际则以荧光假单胞菌和施氏假单胞菌为主；大麦根面以荧光假单胞菌和施氏假单胞菌为主，根际中除了荧光假单胞菌外，还有门多萨假单胞菌和阴沟肠杆菌。第三、耕作对反硝化作用也存在影响。在培育条件下，用乙炔抑制法测定得到的太湖地区的潴育性水稻土和潜育性水稻土的免耕区土壤中，硝酸还原酶及 原酶活性都明显低于普耕区土壤 这与其他免耕覆盖土壤中氮素损失的研究结果相悖。因此他们提出关于免耕是否有助于减少氮素损失尚需在原位土壤中加以验证。第四、在不同类型的土壤，反硝化作用存在差别。研究的结果发现，太湖地区主要类型土壤 中的反硝化势（培育 4 天为例），以中性和微酸性潜育性水稻最高，形成的 N 分别为 234 和 223 g/g 土；粘壤质和粉沙质潴育性水稻土最低，分别只有 g/g 土。并认为，土壤对反硝化的影响可能和水分及有机质的含量有关。 土壤中反硝化细菌的数量、种类、酶活性及生态条件等与反硝化作用程度密切相关。中国科学院南京土壤研究所在这方面做了较多的工作（李振高等， 1993）。他们对土壤中的反硝化细菌进行了较为系统的研究。 水稻田中发生的反硝化作用是由土壤和水稻根际两者氧化层和还原层分异引起的。无定形中国农业科学院硕士学位论文 引言 4 铁、锰 氧化物作为厌气条件下铵根氧化时的电子受体，使得反硝化作用更易获得硝酸根，从而加速水田中的反硝化作用（李良谟， 1988）。 3. 反硝化细菌的分布及特点 反硝化作用是由具有反硝化能力的反硝化细菌完成的。反硝化细菌是一类能够以硝酸盐或亚硝酸盐、作为电子受体完成有机物或无机物（硫或氢）氧化，同时还原硝酸盐或亚硝酸盐为氮气的细菌。从微生物学的角度看，反硝化作用是反硝化细菌的厌氧呼吸过程，硝酸盐是电子受体，氮气是代谢产物，要完成这个厌氧呼吸过程，必须不断的从外界获得电子供体（通常为有机物）。不像硝化细菌，反硝化细菌在 分类学上没有专门的类群，它分散于原核生