β—七叶皂苷钠对心肺复苏后大鼠脑细胞中低氧诱导因子—1α的影响

七叶皂苷钠对心肺复苏后大鼠脑细胞中低氧诱导因子1的影响【摘要】目的探讨自主循环恢复（returnofspontaneouscirculation，ROSC）后大鼠脑细胞中低氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）的表达及-七叶皂苷钠对其影响。方法清洁级SD成年大鼠60只，随机（随机数字法）分3组（n=20）。（1）实验组：ROSC后即刻腹腔注射-七叶皂苷钠（5mg/kg）一次；（2）对照组：ROSC后即刻腹腔注射等量生理盐水一次；（3）假手术组：未经历心搏骤停-心肺复苏和未给药。采用窒息合并冰氯化钾停跳液法制备大鼠心搏骤停-心肺复苏模型。分别在ROSC后1、6、12、24h抽血，然后处死取脑组织。ELISA检测血清NSE、S100，免疫组化和Real-timePCR检测脑细胞HIF-1、VEGF、EPO蛋白和mRNA。各组同一时间点之间比较采用成组t检验，组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni法。相关性分析采用Pearson法。结果与假手术组比较，ROSC后1、6、12和24h对照组大鼠血清NSE与S100明显升高（P【关键词】心肺复苏；低氧诱导因子-1；促红细胞生成素；血管内皮生长因子；神经元特异性烯醇化酶；S100蛋白；-七叶皂苷钠；脑保护Effectof-sodiumaescinateonhypoxia-induciblefactor-1expressioninratbrainneuronsaftercardiopulmonaryresuscitationKANGJian，GONGPing，RENYan-bo，GAODong-na，DINGQiong-lei.DepartmentofEmergency，theFirstHospitalAffiliatedtoDalianMedicalUniversity，Dalian116011，ChinaCorrespondingauthor：KANGJian，Email：【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofthehypoxia-induciblefactor（HIF）-1inratbrainneuronsandtheinterventionof-sodiumaescinateafterrestorationofspontaneouscirculation（ROSC）.MethodsSixtySDadultratswererandomly（randomnumber）dividedinto3groups（n=20），namelyexperimentgroup，controlgroupandshamoperationgroup.（1）Theratsofexperimentgroupwereinjectedintraperitoneallywith-sodiumaescinate（5mg/kg）immediatelyafterROSC.（2）Theratsofcontrolgroupreceivednormalsalineinjectedintraperitoneallyinsteadof-sodiumaescinatesolution.（3）Theratsofshamoperationgroupdidnothavecardiacarrestand-sodiumaescinateintervention.Cardiacarrestratmodelwasestablishedbyusingasphyxiationandintra-venouspotassiumchloridesolution.Bloodsamplesweretaken1h，6h，12hand24hafterROSC，andsubsequentlyratsweresacrificedandtheirbraintissueswereharvested.TheexpressionsofHIF-1mRNA，vascularendothelialgrowthfactor（VEGF）mRNAanderythropoitin（EPO）mRNAandtheirproteinlevelsinratbrainneuronsweredetectedbyusingRT-PCRandimmunohistochemistry，andthelevelsofserumneuron-specificenolase（NSE）andS100proteinsweredeterminedbyusingenzyme-linkedimmunosorbentassay.Thettestorone-wayANOVAwasusedtoassessoveralldifferencesamonggroupsforeachofthevariables，followedbyBonferronitestformultiplecomparisons.Pearsonmethodwasusedforcorrelationanalysis.ResultsComparedwiththeshamoperationgroupatintervalsof1h，6h，12hand24hafterROSC，levelsofserumS100andNSEproteinsweresignificantlyincreasedinratsofthecontrolgroup（P心搏骤停患者自主循环恢复（returnofspontaneouscirculation，ROSC）后脑组织经历了缺血和再灌注两个阶段的损伤1-2。脑细胞功能恢复程度是衡量心肺复苏（cardiopulmonaryresuscitation，CPR）成功的关键3-4。研究发现，低氧诱导因子-1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-）作为基因转录的核调节因子，被缺氧激活后可转录促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等多个下游基因，启动缺血缺氧后一系列病理生理学机制，从而起到脑保护作用5-7。-七叶皂苷钠（-sodiumaescinate）因具有抗炎、抗水肿和清除氧自由基等作用，已经广泛应用于各种水肿的治疗8，但是它对HIF-1影响尚无研究。本实验采用窒息合并冰氯化钾停跳液法制备大鼠心搏骤停模型，通过Real-timePCR、免疫组化及ELISA等检测心肺复苏后大鼠脑细胞HIF-1、VEGF和EPO表达，以及-七叶皂苷钠干预对其的影响。1材料与方法1.1实验动物及分组清洁级SD成年大鼠60只（大连医科大学动物中心提供），雌雄不拘，体质量300350g。按随机数字表法分3组（n=20）。（1）实验组：ROSC后即刻腹腔注射-七叶皂苷钠（5mg/kg）1次；（2）对照组：ROSC后即刻腹腔注射等量生理盐水1次；（3）假手术组：未经历心搏骤停-心肺复苏和未给药。1.2方法1.2.1心搏骤停大鼠模型的制备及取材大鼠术前禁食，自由饮水。氯胺酮（100mg/kg）腹腔注射麻醉。分离股动、静脉，股静脉置管连接微量泵输液装置，持续泵入生理盐水（2ml/h）。股动脉置入24号套管，通过换能器（ZH0144，中国淮北正华公司）连接动物心电监护仪（SurgiVetV3404，香港友诚公司），监测动脉血压和心率；分离气管，插入气管导管。采用窒息合并冰氯化钾停跳液方法9制备心搏骤停大鼠模型。心脏骤停标准：自主心律波形消失，平均动脉压小于30mmHg（1mmHg=0.133kPa）。5min后开始CPR。胸外按压频率160200次/min，同时连接小动物呼吸机（TKR-200C，北京亚泰科隆公司），呼吸频率80次/min，潮气量2.5ml，100%纯氧吸入，静注肾上腺素（0.01mg/kg）和阿托品（0.01mg/kg）。ROSC标准：出现自主心律，收缩压60mmHg，持续10min以上。分别在ROSC后1、6、12、24h（n=5）经大鼠眼眶静脉丛采血；然后迅速打开胸腔暴露心脏，分离腹主动脉、下腔静脉并用缝线结扎，从心尖进针入左心室深至主动脉根部，止血钳夹闭进针点以固定，将右心耳处切开一小口，先以生理盐水快速心脏灌注，至流出的液体澄清，肺叶颜色呈亮白色，4%多聚甲醛100ml快速灌注，约200ml再缓慢灌注。灌注结束后立即断头打开颅骨取出脑组织，一侧半球于多聚甲醛中保存，另一部分于-80冰箱中保存。所有实验参数设计和记录均参照复苏实验研究的Utstein模式10-11。1.2.2ELISA检测采用ELISA法检测大鼠血清NSE（北京中杉金桥生物技术有限公司）、S100（北京中杉金桥生物技术有限公司），实验操作按试剂盒说明书进行。1.2.3免疫组化严格按照试剂盒操作说明书进行检测。一抗为EPO（1150，SantaCruz，美国）、HIF-1（1200，北京博奥森生物技术有限公司）、VEGF（1150，SantaCruz，美国）。用Imageproplus软件分析。每组5张切片，每张5个高倍（400）视野，测平均光密度。1.2.4Real-timePCR检测按TRIzol（TaKaRa）试剂说明书提取组织RNA，于-80冰箱中保存备用。将各个样品总RNA稀释至相同浓度，使用PrimeScriptRT-PCRKit试剂盒按50l的反应体系制备cDNA，操作步骤参照试剂盒说明书。然后采用TapMan探针法进行Real-timePCR。HIF-1引物大小为135bp，上游引物：5-ATTCTCCAAGCCTCCGA-3，下游引物：5-TCATCCATTGACTGCCCC-3；EPO引物大小为176bp，上游引物：5-GAATTGATGTCGCCTCCAGA-3，下游引物：5-CCAAGCCGCTCCACTCCGAACA-3；VEGF引物大小为158bp，上游引物：5-TTCAAGCCGTCCTGTGTGC-3，下游引物：5-TCCAGGGCTTCATCATTGC-3；内参照-actin引物大小为165bp，上游引物：5-GACCTGACTGACTACCTCAT-3，下游引物：5-TCGTCATACTCCTGCTTGCT-3。上述引物均由大连宝生物工程有限公司（Takara）设计合成。采用QuantscriptRTKit（TiangenBiotech，Beijing，China）进行Real-timePCR分析。所测基因的循环时间（Ct）用-actin标准化。每个样本测3次。1.3统计学方法应用SPSS13.0软件包进行统计学处理。所有数据采用（xs）表示。各组同一时间点之间比较采用成组t检验，组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni法。EPOmRNA与HIF-1mRNA表达之间的相关性采用Pearson相关分析。以P2结果2.1大鼠血清S100和NSE与假手术组比较，对照组大鼠血清S100在1h后开始升高，6h时达高峰，持续到24h；NSE在6h后开始升高，12h时达高峰，持续到24h。与对照组相比，实验组大鼠各时间点的血清NSE、S100均明显降低，见表1。2.2大鼠脑细胞HIF-1、VEGF和EPO蛋白的表达与假手术组比较，ROSC后1、6、12和24h对照组HIF-1、VEGF和EPO蛋白表达上调。与对照组比较，实验组各时间点HIF-1、VEGF、EPO蛋白表达上调（ROSC后12h见图1）。2.3大鼠脑细胞HIF-1、VEGF、EPOmRNA表达与假手术组比较，对照组HIF-1、VEGF和EPOmRNA表达从ROSC后6h开始升高，持续至24h。与对照组比较，实验组HIF-1、VEGF、EPOmRNA表达均增加，见表2。Pearson相关分析显示，心肺复苏后大鼠脑细胞HIF-1mRNA与EPOmRNA呈正相关（r=0.952，P3讨论在本实验中，笔者发现心肺复苏后大鼠血清中S100、NSE明显增加；脑神经细胞HIF-1、VEGF、EPO蛋白和mRNA表达均明显增加；-七叶皂苷钠能上调HIF-1、VEGF、EPO蛋白和mRNA的表达。HIF-1是细胞在缺氧等条件下稳定表达的具有转录活性的蛋白，通过与多种靶基因调控区的缺氧反应元件结合，调控靶基因，如EPO、VEGF、诱导型NO合酶、葡萄糖载体蛋白等的表达5-7，使机体对缺血、缺氧等病理生理过程产生适应性反应。VEGF是HIF-1的一个重要靶基因，也是血管生成的主要调节因子。脑缺血缺氧后，HIF-1高表达可诱导增加VEGF表达，促进血管生成，促进微循环重建，增加缺血组织血流灌注和供氧量，加快脑缺血缺氧的恢复过程12；保护内皮细胞，从而保护血脑屏障，减轻脑水肿；清除氧自由基，保护缺血-再灌注组织；VEGF还可以刺激神经元轴突生长，促进胶质细胞分裂、迁移、存活，促进神经再生，对神经组织有直接的保护作用13。相反，阻断HIF-1表达可降低VEGF表达，导致血管发展缺陷14。EPO可在中枢神经系统表达，具有神经保护作用。缺氧能迅速活化HIF-1，从而促进EPO的表达和释放。EPO的经典作用是提高血液内红细胞的数量和携氧量；EPO通过抗凋亡作用对缺血-再灌注组织发挥保护作用；EPO具有保护血管，保持血管内皮细胞完整性，促进血管新生的作用15-16；EPO通过上调抗氧化酶的表达及下调氧自由基的生成，起抗氧化作用；EPO抑制许多致炎因子的释放，减轻炎性细胞的浸润，清除自由基，抗炎症、抗凋亡、提高神经突触传递等提高对缺血的耐受性，对缺血-再灌注组织发挥保护作用17。神经元特异性烯醇化酶（NSE）是烯醇化酶的二聚体同工酶，特征性地位于神经元和神经内分泌细胞胞质中，若神经元发生坏死，NSE会漏到细胞外，使体液中NSE浓度升高。S100蛋白是一类分子量较小的酸性结合蛋白，具有广泛的生物学活性，在细胞增殖分化、肌肉收缩、基因表达、分泌及细胞凋亡中发挥重要作用。S100蛋白在脑组织中含量丰富，当脑组织受损后，脑脊液中升高的S100就通过受损的血脑屏障进入血液。故血清NSE、S100蛋白水平可作为诊断心肺复苏后早期脑损伤程度有价值指标。本研究显示，ROSC后大鼠血清NSE、S100蛋白明显升高，提示心肺复苏后脑组织因缺血缺氧而损伤严重。ROSC后1、6、12、24h大鼠脑细胞中HIF-1、VEGF、EPO蛋白和mRNA表达均明显增加，提示脑缺血缺氧后HIF-1及受其调控的下游基因VEGF、EPOmRNA和蛋白表达均上调，这可能是机体对心肺复苏后全脑缺血缺氧的适应性反应。-七叶皂苷钠是从中药婆罗子干燥果实中提取的三萜皂苷钠盐，具有抗渗出、消肿等作用，目前临床上已广泛应用于各种病因导致的水肿，尤其是脑水肿的治疗8，具有不良反应小，不引起水盐代谢失调、肾功能的损害，对循环系统影响小等优点。Janssens等18研究表明，-七叶皂苷钠可以拮抗低氧状态下组织细胞ATP含量减少，维持细胞的泵功能，从而减轻组织细胞的损伤；还可以通过上调大鼠脑缺血-再灌注损伤后SOD的表达，清除氧自由基；上调Bcl-2及下调Caspase-3的表达抑制神经细胞凋亡等机制来保护神经细胞功能。本研究显示，给予-七叶皂苷钠干预后，大鼠血清NSE、S100蛋白明显降低，说明-七叶皂苷钠干预治疗可以减轻脑组织的损伤。更重要的是，给予-七叶皂苷钠干预后大鼠脑组织HIF-1、EPO、VEGFmRNA和蛋白表达均明显增加，提示-七叶皂苷钠还可能通过上调HIF-1及其下游基因的表达而发挥神经保护作用。但随着缺氧时间的延长，上述指标呈何种趋势，本研究未加证实，尚需进一步深入研究。参考文献1张明月，季宪飞，李春盛.心肺复苏后猪各主要脏器组织和超微结构的变化及对血流动力学的影响J.中华急诊医学杂志，2010，19（10）：1019-1026.2李春盛.心肺复苏的研究进展J.中华急诊医学杂志，2011，20（1）：11-13.3李春盛，龚平.我国心肺复苏的近10年研究进展J.中华急诊医学杂志，2012，21（1）：5-8.4黄子通，符岳.脑复苏研究现状与展望J.中华急诊医学杂志，2011，20（2）：124-125.5EmaM，HirotaK，MimuraJ，etal.MolecularmechanismsoftranscriptionactivationbyHLFandHIF1alphainresponsetohypoxia：theirstabilizationandredoxsignal-inducedinteractionwithCBP/p300J.EMBOJ，1999，18（7）：1905-1914.6SemenzaG.Signaltransductiontohypoxia-induciblefactor1J.BiochemPharmacol，2002，64（5/6）：993-998.7杨乐，邹晓静.缺氧诱导因子-1对脂多糖所致心肌细胞线粒体功能损伤的影响J.中华急诊医学杂志，2012，21（8）：836-839.8陈俊，陈寿权，李章平，等.七叶皂苷对心肺复苏后大鼠脑水肿期脑水通道蛋白4mRNA变化的作用J.中国中西医结合急救杂志，2007，14（4）：245-249.9潘曙明，杨兴易，林兆奋，等.全脑缺血-再灌注后大鼠脑神经元NF-B的表达J.中华急诊医学杂志，2003，12（11）：742-745.10宋维，陈实，刘元税，等.基于乌斯坦因模式的心肺复苏研究报告J.中华急诊医学杂志，2012，21（9）：1003-1006.11AhamedHI，LanceBB，JosephPO，etal.Vtstein-StyleguidelinesforuniformreportingoflaboratoryCPRresearchJ.Circulation，1996，94（9）：2324-2336.12RaviR，MookerjeeB，BhujwallaZM，etal.Regulationoftumorangiogenesisbyp53-induceddegradationofhypoxia-induciblefactor1alphaJ.GenesDev，2000，14（1）：34-44.13MoserKV，HumpelC.VascularendothelialgrowthfactorcounteractsNMDA-inducedcelldeathinratbasalnucleusofMeynertJ.BrainResBull，2005，65（2）：125-131.14StoeltzingO，McCartyMF，WeyJS，etal.Roleofhypoxia-induciblefactor1alphaingastriccancercellgrowth，