中药黄芩HPLC指纹图谱的化学轮廓及其影响因素的研究

中药黄芩HPLC指纹图谱的化学轮廓及其影响因素的研究摘要目的建立中药黄芩HPLC指纹图谱方法，研究指纹图谱化学轮廓及其影响因素，为黄芩HPLC指纹图谱方法的推广应用提供参考依据。方法采用HPLC指纹图谱分析方法对7个省区83份黄芩（Scutellariabaicalensis根）的化学成分进行测定，考察色谱柱、色谱仪、洗脱梯度、检测波长等因素对指纹图谱的影响，对色谱方法的普适性和耐用性作出系统评价。结果用83份黄芩样品建立的黄芩HPLC指纹图谱中有29个共有峰，利用对照品和LC-MS技术对黄芩指纹谱中的27个化合物进行了指认和鉴定；在一定的条件下所建立的指纹谱方法具有良好的精密度、重复性，黄芩供试品溶液在72h内稳定性良好。在考察各因素中发现，检测波长对指纹谱的化学轮廓影响很大；分别变换色谱仪、色谱柱或洗脱梯度等色谱条件对指纹谱化学轮廓产生的影响亦较大。结论所建立的黄芩HPLC指纹图谱方法在一定条件下具有很好的稳定性和实用性，可用于黄芩药材的化学轮廓研究，进而评价黄芩的质量。但是指纹图谱在实际应用中须严格控制规定的测定条件，以确保所得指纹图谱稳定可靠。关键词黄芩；HPLC指纹图谱；化学轮廓；LC-MS中图分类号R944文献标识码A文章编号1673-7210（2013）02（b）-0096-07中药黄芩为唇形科植物贝加尔黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）的干燥根1，是常用中药材之一。近年来HPLC指纹图谱已被应用于中药黄芩的质量控制评价药材的整体化学特征，LC-MS、NMR技术更提供了丰富的结构信息，使得在化学实验室中进行中药的质量控制更加完善2-4。然而在实际的推广和应用中，HPLC指纹图谱检测常受到液相色谱仪、色谱柱、检测波长、流动相、洗脱梯度等条件的影响，色谱方法的普适性和耐用性直接决定其实际的应用价值。本文利用建立的中药黄芩的HPLC指纹图谱方法，系统考察改变部分色谱条件（不同仪器、色谱柱、柱温、流动相的洗脱梯度等）对黄芩提取物指纹图谱的影响，找出主要的影响因素，并对指纹图谱方法的普适性和耐用性作出了明确的评价。本研究可为黄芩指纹图谱的质量控制和方法推广提供科学依据。1仪器与试药1.1仪器及色谱柱仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪，配有G1312A二元泵、G1315DDAD检测器，Agilent化学工作站；Waters2690-996液相色谱仪配有2690系列四元泵、996紫外二极管阵列检测器、Millennium32工作站。LC-MS-IT-TOF液质联用仪（Shimadzu，Japan），配有ESI源、二极管阵列检测器、自动进样器、LCMSsolution3.50工作站；分子式预测软件（Shimadzu，Japan）。4种色谱柱：14号色谱柱见表1。1.2试剂甲醇（Fisher公司，色谱纯），无水甲酸（分析纯，天津光复精细化工研究所），双蒸水（娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团）。对照品：黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2，6-4OH黄酮、粘毛黄芩素，是由天然药物学实验室制备，经纯度鉴定，均达到98%以上，符合要求。1.3药材本实验检测药材共计83份，其中21份产自甘肃，10份产自山东，17份产自河北，12份产自陕西，13份产自山西，8份产自内蒙古，2份产自黑龙江，全部药材经北京大学药学院生药学研究室蔡少青教授鉴定为唇形科黄芩属植物贝加尔黄芩的干燥根，凭证标本存放于北京大学药学院生药标本室。2方法与结果2.1对照品溶液制备将对照品适量溶解在70%甲醇溶液中，超声至完全溶解，过0.45m微孔滤膜，即得。2.2样品制备去粗皮，茎残基及根茎，主根剪成12cm的短节，粉碎并过40目筛，在55下干燥2h，迅速精密称定0.5g，置入具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50.00mL，室温超声提取30min，稍静置至澄清，上清液用0.45m微孔滤膜过滤，即得。2.3色谱和质谱条件2.3.1方法一色谱条件：Agilent1200液相色谱仪，色谱分析柱为PhenomenexGeminiC18柱（250mm4.6mm，5m），流动相为A相1%甲酸水溶液，B相为甲醇，流速为1mL/min，检测波长为274nm，进样量为10L，柱温为30。梯度洗脱见表2。2.3.2方法二色谱条件：Waters2690-996液相色谱仪，IntersilODS-3色谱分析柱（250mm4.6mm，5m），柱温为35；流动相为A相1%甲酸水溶液，B相为甲醇，流速为1mL/min。梯度变化见表3。2.3.3质谱条件质谱使用ESI离子源，正离子模式喷雾电压4.5kV，负离子模式喷雾电压-3.5kV。加热模块（BH）温度为200；曲型脱溶剂管（CDL）温度为200。雾化气采用氮气（纯度99.5%），流速1.5L/min，检测器电压1.70kV。高纯氩气（纯度99.99%）作为CID碰撞气及冷却气。使用三氟醋酸钠（2.5mmol/L）溶液对正、负离子模式m/z1001000的范围进行质量数校正。使用自动采集模式，每一级自动选择基峰离子作为下一级的母离子进行碎裂。2.4色谱方法（方法一）的建立与验证2.4.1黄芩指纹图谱特征结果表明，在274nm检测下指纹图谱中13号峰峰面积最大，它是黄芩中含量最大的成分黄芩苷的峰；其次还显示了汉黄芩苷（20号峰）、黄芩素（24号峰）、汉黄芩素（26号峰）、千层纸素A苷（19号峰）、千层纸素A（27号峰）、去甲汉黄芩苷（15号峰）等含量较大的黄酮类成分，此外尚含阿替苷（3号峰）等非黄酮类活性成分。这些成分吸收峰明显，且多具有解热、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、降压、抗衰老、神经保护、抑制大鼠前列腺增生等活性5-8，故可以在本论文所建立的指纹图谱条件下，利用这些成分对黄芩进行综合的质量控制。2.4.2方法学验证专属性试验是以空白溶液（甲醇）10L进样，按“2.3”项下方法一色谱条件进行测定，得到图1A中色谱图，说明基线平稳，对样品检测干扰较小。在同批黄芩药材（产于河北省丰宁县围场镇，编号：5791，野生黄芩）中平行取样7份，每份重量2030g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液7份，分别进样10L，按“2.3”项下方法一色谱条件进行分析，各主要色谱峰的峰面积的RSD值基本小于5%，表明方法重复性良好。见表4。取黄芩药材（河北省隆化县韩麻营镇，编号：5786，栽培黄芩）的同一份供试品溶液连续进样6次，每次10L，6次检测结果的主要色谱峰面积的RSD值基本小于5%，保留时间的RSD值小于0.5%，说明仪器精密度良好。见表5。在0、3、6、12、24、48、72h对黄芩药材（编号：200709001）的同一份供试品溶液进行检测，主要色谱峰面积的RSD值基本小于5%，说明样品稳定性良好。见表6。2.5指纹峰的鉴定在“2.3.1”项下方法一色谱条件下，利用对照品对黄芩药材中10个成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A苷、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2，6-四羟基黄酮、粘毛黄芩素进行了指认和鉴定。并参照参考文献中黄芩成分的MS裂解规律和紫外吸收特征，对黄芩指纹图谱中其余的17个主要色谱峰进行了鉴定。图2A为黄芩提取物在正负离子模式下的总离子流图，图2B为相应的紫外色谱图，测定结果表明所检测的83份黄芩提取物指纹谱中均有129号峰，即这29个峰为黄芩的共有峰。其LC-MSn数据见表7，依照紫外吸收和裂解规律推断未被鉴定的两个化合物7、10应是黄酮类六碳糖苷和六碳糖苷酸。2.6指纹图谱的影响因素2.6.1不同检测波长对黄芩指纹图谱的影响对样品编号为6628的药材（产于河北省丰宁县，野生黄芩）供试溶液进行指纹图谱检测，其他条件同“2.3”项下方法一，比较在不同波长（250350nm）下总峰数和各主要色谱峰的面积及相对色谱峰面积（以黄芩苷峰面积为100%）、指纹谱总峰面积，发现检测波长对指纹谱有显著影响。2.6.1.1不同波长下检测到的色谱峰数不同，274nm下可检测到色谱峰数为62个，350nm下仅能检测到38个色谱峰，14、22、29号色谱峰不能被积分。见表8。2.6.1.2色谱峰面积和相对峰面积在不同波长下差异很大。以1号峰二氢粘毛黄芩素为例，在274nm处峰面积为521.8mAUs、相对峰面积为1.1%，350nm处其峰面积仅为74.2mAUs、相对峰面积为0.8%，而在300nm处其峰面积为665.0mAUS，约是350nm处的9倍，相对峰面积为2.4%，约是350nm处的3倍。2.6.1.3与274nm下的色谱图B相比，A、C、D图的18号峰群、911号峰群的模式都发生了明显变化，见图3。综上，检测波长的变化对指纹图谱化学轮廓的影响是非常显著的。2.6.2不同色谱柱对黄芩指纹图谱的影响对14号的色谱柱的色谱行为进行考察，其他条件同“2.3”项下色谱方法一，检测黄芩药材样品（产于山西省榆社县，编号：Hq2001004，栽培黄芩）的供试溶液。得到色谱图（图4），对照紫外光谱，对129号化合物进行标示。2.6.2.1使用3号柱、4号柱（方法一所用色谱柱）检测到的指纹图谱轮廓接近，二者图谱中色谱峰出峰种类、出峰顺序一致，除10号峰外，其他129号色谱峰均得到分离。2.6.2.21号色谱柱上化合物的保留时间改变，典型的24、25号色谱峰较3、4号柱保留时间前移，分离度降低，没有分离出2123号色谱峰，但出峰顺序与3、4号柱一致。2.6.2.32号色谱柱出峰顺序与1、3、4号色谱柱不同，24号峰出峰在21号峰之前，没有检测到22号色谱峰。综上，不同品牌型号色谱柱的分离效果有很大的不同，因而检测到的黄芩指纹图谱化学轮廓很不一致。例如2号柱，它是苯基-己基柱，由于保留特性与C18柱差异较大，故造成了出峰顺序的改变，从而导致指纹图谱化学轮廓的显著改变。2.6.3洗脱梯度对黄芩指纹图谱的影响对流动相甲醇-1%甲酸水溶液4种不同的洗脱梯度（表9）进行了考察。色谱条件为：检测波长为274nm，Agilent1200色谱仪，GeminiC18柱（4.6mm250mm，5m），柱温为30，流速为1mL/min，样品为药材（产于甘肃省渭源县会川镇，编号：5607，栽培黄芩）的供试溶液，进样量10L，得到色谱（图5）。4种洗脱梯度下，虽然化合物的种类、出峰顺序一致（图5），主要色谱峰的峰面积、相对峰面积（以黄芩苷峰面积为100%）较为接近（表10），即指纹图谱的化学轮廓基本一致，但是129号色谱峰的保留时间及分离度有很大变化，且一些峰面积较小、保留相近的化合物没有得到完全分离。说明洗脱梯度变化对黄芩指纹图谱的影响很大。2.6.4多因素对黄芩指纹图谱的影响在274nm检测波长下，改变其他条件以考察色谱方法普适性、耐用性。在方法二色谱条件下得到黄芩药材（产于黑龙江省杜蒙县一心乡，编号：99002，野生黄芩）的供试溶液的色谱图（图6B）。对照紫外光谱对方法二检测的指纹图谱色谱峰进行标示，与原方法色谱图（图6A）相比，可见两种方法检测到的指纹图谱中，色谱峰的化合物种类、出峰顺序没有发生改变，提取物指纹图谱化学轮廓没有明显的改变，但是指纹峰的保留时间和分离度发生了较大的变化。3讨论本文利用83份不同产地的黄芩样品建立了包含29个共有峰的中药黄芩HPLC指纹图谱，利用对照品和LC-MSn技术对其中的27个化合物进行了指认和鉴定，在一定条件下该方法具有良好的精密度、稳定性、重复性。所建立的黄芩HPLC指纹图谱方法在一定条件下具有很好的稳定性和实用性，可用于黄芩药材的化学轮廓研究进而评价黄芩的质量；利用此方法，进一步从化学角度对不同规格和产地的黄芩药材进行比较，与课题组前期所做的对不同规格的黄芩药材及非道地与道地黄芩药材的药效学试验9-10比对，可用于黄芩谱效关系的研究。但是指纹图谱方法在实际应用条件下运行时，常受到多种因素的影响。本文分别考察了不同检测波长、色谱柱、洗脱梯度以及综合测定条件对指纹图谱的影响，结果显示，在其他条件固定的情况下，检测波长对黄芩指纹图谱的化学轮廓影响很大；分别使用不同色谱柱、不同柱温、不同洗脱梯度的情况下得到的指纹图谱，虽然化合物种类、出峰顺序都没有明显变化，但是色谱峰的保留时间和分离度会发生很大的变化，并会导致提取物化学轮廓发生较大的改变。变换色谱仪厂牌和柱温亦可以对指纹峰的保留时间和分离度产生较大的影响。所以黄芩指纹图谱在实际应用中须严格控制规定的测定条件和各种因素，以确保所得指纹图谱稳定可靠。参考文献1国家药典委员会.中国药典S.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：282.2LeiZhang，Ruo-WenZhang，QingLi，etal.DevelopmentofthefingerprintsforthequalityevaluationofscutellariaRadixbyHPLC-DADandLC-MS-MSJ.Chromatogr，2007，66（1-2）：13.3GuozhuLiu，JinyuMa，YingzhuangChen，etal.InvestigationofflavonoidprofileofScutellariabacalensisGeorgibyhighperformanceliquidchromatographywithdiodearr