呋喃西林代谢物快速检测.doc

呋喃西林代谢物（SEM）快速检测试一、 原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的SEM，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的SEM和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的SEM含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。 二、 试剂盒技术指标： 试剂盒灵敏度： 0.1ppb 样本检测下限： 组织、蜂蜜 0.2ppb 回收率： 鱼/虾水产组织 85%10% 蜂蜜/鸡肉/肝脏样本75%15% 交叉反应率： 呋喃西林代谢物 100% 呋喃它酮代谢物 0.1% 呋喃妥因代谢物 0.1% 呋喃唑酮代谢物 0.1% 三、试剂盒组成 1微量测试孔：每条8孔，一板12条 2标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb 3酶标记物 12ml红色帽 4抗体浓缩液 1ml. 蓝色帽 5底物A液 7 ml白色帽 6底物B液 7 ml . 黑色帽 7终止液 7 ml 黄色帽 820X浓缩洗涤液40 ml 白色帽 92X浓缩复溶液 50 ml 透明帽 1010ml衍生化试剂. 白色帽 （不能与其它衍生化试剂混用） 11. 样本提取液 500ml 黑色帽 （不能与其它试剂混用） 四、 所用仪器、试剂 具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g） 微量移液器：单道20l-200l，100l-1000l、多道250l 试 剂：氢氧化钠、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5NO3H2O）ZnSO47H2O 五、样本前处理步骤 样本处理前须知 处理任何样本时，都必须注意： （a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理需配制： 1用去离子水将2浓缩复溶液按1：1 稀释，用于提取后的样本复溶 2C液：（供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。 D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。 30.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO43H2O 加去离子水溶解定溶至1L 41M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。 51M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。 样本的处理 (a) 肉样或鱼虾 用均质器均质样本,接（d）的描述方法 (b) 奶样 1. 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250l。 2. 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8,然后离心。 3. 接(d)的描述方法 (c) 蜂蜜 1. 取10.05g样本到离心管中。 2. 加入4ml的去离子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100l衍生化试剂,充分振荡。 3. 接(d)第2步描述方法 (d)接上面的方法 1.取10.05g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛 奶的离心上清液1.1ml（相当1ml奶样）， 分别加入4ml的去离子水，0.5ml1M HCl 和100l衍生化试剂，充分振荡。 2.置于37过夜孵育（大约16h）。 3.分别加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml的样本提取液，充分振荡30s； 4.在室温下（20-25）4000r/min以上离心 10min。 5.取出2.5ml的样本提取液到另一洁净容器中 于50氮气/空气吹干。 6.用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释 好的复溶液充分混合；在室温下（20-25） 4000r/min以上离心10min。 7.取50l下层相用于分析。 样本稀释倍数：2 六、酶标免疫分析程序 1从4冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8。 3配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用（或按需要量稀释）。 4编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 5. 将浓缩抗体用已稀释好的复溶液11倍稀释（1份抗体加入10份稀释液） 6加标准品/样本 50l/孔到各自的微孔中，然后加抗体50l/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37环境中反应30min。 7取出将孔内液体甩干，用洗液250l/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 8每孔加入酶标记物100l，盖板膜盖板后置37环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 9显色：每孔加入底物A液50l，再加底物B液50l，轻轻振荡混匀，37环境中避光显色15min。 10测定：每孔加入终止液50l，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。 七、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与SEM的含量成负相关。 1、定性判定： 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含SEM浓度范围 （ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.671；0.1ppb为1.425；0.3ppb为1.103； 0.9ppb为0.567； 2.7ppb为0.205； 8.1ppb为0.104。则样品1的浓度范围是0.9ppb-2.7ppb；样品2的浓度范围是0.1ppb-0.3ppb。（再乘以相应的稀释倍数） 2、定量判定： 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%） B 100% B0 B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B00ng/ml标准溶液的平均吸光度值 以标准品百分吸光率为纵坐标，以SEM标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。 若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。 八、注意事项 1用前将所有试剂温度回升至室温20-25。 2用之后立即将所有试剂放回2-8冰箱。 3在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的 洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。 4.所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 5室温低于37或试剂及标本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的OD值偏低。 6在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 7混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。 8反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 9不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释 或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换