分子实验——影响PCR扩增因素的分析.doc

影响PCR扩增因素的分析【摘要】聚合酶链反应(PCR)技术问世以来，已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断完善，不仅广泛应用在基础研究领域，在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。该反应具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点,经过不断改良，PCR技术已成为分子生物学研究常用的手段。通过阅读大量文献资料，本文对聚合酶链式反应(PCR)的基本概念、工作原理以及影响其扩增的因素各方面作了概述。【关键词】聚合酶链式反应(PCR) 温度 引物 Taq DNA聚合酶前言:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验发现，DNA在高温时发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其最基本的3个环节是:DNA变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。 退火（复性）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 延伸：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。由以上三个环节组成一个周期，循环进行，每一循环，DNA含量增加一倍，此方法操作简便快速，并且非常有效，可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。目前为止，PCR技术已有十几种之多，如将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。1.引物要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。设计引物应遵循以下原则： 引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。 引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%60%为佳，+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，引物之间两个引物之间不应发生互补。特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。 引物3端配对DNA聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所以引物3端56个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。2.酶及其浓度早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶纯品。DNA聚合酶是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有35外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有53外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有35外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是53外切酶活力，它能从5端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法，以Klenow片段完成-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。PCR反应中最常用的DNA聚合酶即Taq DNA聚合酶。用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度。二者相比，其主要区别在于：Klenow酶的最适温度为37，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为7475。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1g基因组DNA开始）而Taq酶为30个。延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3.dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4.模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。5.Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。6.温度与时间的设置在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如通常操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：9460s, 3760s, 72120s，共2530个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要3060s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。变性温度与时间变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般试验中退火温度Ta (annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5，可按公式进行计算： Ta = Tm - 5= 4(G+C)+ 2(A+T) -5 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G+C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55。在典型的引物浓度时（如0.2mol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于90时，DNA合成几乎不能进行 PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb 需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。7.循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在2540次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。但实验过程中，一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置4保存。参考文献1 朱玉贤，李毅编著. 现代分子生物学，第3版，北京：高等教育出版社，2007.112 魏