细菌的培养与分离技术.doc

临床医学检验主管技师考试辅导 微生物检验 第十二章细菌的培养与分离技术本章考点：1.基本条件 （1）细菌实验室（2）无菌实验室（3）基本设备和器具2.细菌的接种与分离技术 （1）平板划线分离法（2）斜面接种法（3）液体接种法（4）穿刺接种法（5）倾注平板法（6）涂布接种法3.细菌培养的方法 （1）需氧培养法（2）二氧化碳培养法（3）厌氧培养法4.细菌的生长现象 （1）分离培养基上菌落的生长现象（2）细菌在液体培养基中的生长现象（3）细菌在半固体培养基中的生长现象5.细菌L型的检查（1）标本采集（2）培养方法细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。细菌经培养或分离培养后观察其生长现象，对初步识别细菌的属性很重要。一、基本条件（一）细菌实验室细菌实验室是进行细菌学实验的场所。标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。所以细菌室应该符合一定的条件。1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。 2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。二、细菌的接种与分离技术 接种分离法用途平板划线分离法连续划线分离法主要用于杂菌不多的标本分区划线分离法适用于杂菌量较多的标本斜面接种法要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性液体接种法（避免气溶胶的产生）多用于一些液体生化试验管的接种穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。 （一）需氧培养法本法是临床细菌室最常用的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置于35温箱中孵育1824h，一般细菌可于培养基上生长，但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是2830，如鼠疫耶尔森菌，甚至在4也能生长，如李斯特菌。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置5%l0%C02环境才能生长良好，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌，牛布鲁菌等。常以下列方法供给C02。1.二氧化碳培养箱:是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。C02从钢瓶通过培养箱的C02，运送管进入培养箱内，调节好所需CO2浓度自动控制后，将接种好的培养基直接放入培养箱中培养即可。此法适于大型实验室应用。2.烛缸法:将已接种好的培养基置干燥器内，并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5%l0%，然后将干燥器放入35温箱内培养。培养时间一般为1824h，少数菌种需培养37天或更长。3.化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成C02。（三）厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养法有：疱肉培养基法；焦性没食子酸法；厌氧罐法；气袋法；厌氧手套箱法。四、细菌的生长现象（一）分离培养基上菌落的生长现象1.观察菌落：菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型：（1）光滑型（S型）菌落（2）粗糙型（R型）菌落（3）粘液型（M型）菌落2.血琼脂上的溶血溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。如产气荚膜梭菌。3.气味：通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。4.色素脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄色葡萄球菌的金黄色色素。水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素。（二）细菌在液体培养基中的生长现象浑浊生长：大多数细菌。沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对-内酰胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。1.标本采集:应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。胸水、腹水及尿液标本，应加20%蔗糖无菌溶液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。如增菌肉汤出现轻度混浊或沉淀，再分离接种于L型选择平板或血平板。2.培养方法（1）L型检查程序：将标本接种到高渗肉汤增菌培养17天，然后转种L型平板和血平板37培养27天。L型菌在L型琼脂平板上典型菌落为“荷包蛋”样，但从患者标本中新分离的L型菌落常不典型，多呈颗粒型菌落，涂片染色为多形性。必要时需经传代返祖后进一步鉴定菌种。（2）检验报告：血平板无菌生长，L型平板有菌落生长，可报告检出细菌L型；血平板中菌落细小，不易刮下。涂片检查细菌呈多形性，细胞壁缺损，L型平板中有L型菌落，报告检出L型；血平板及L型平板均有菌落生长。涂片有原菌及L型两种形态特征，可报告细菌型及L型同时存在，并分别作药敏试验以供临床用药参考。本章练习题：单个细菌在固体培养基上生长可形成A.菌丝B.菌落C.菌团D.菌苔E.菌膜答疑编号500735120101正确答案BA.分区划线分离法B.琼脂斜面培养基接种法C.半固体培养基接种法D.液体培养基接种法E.倾注平板法多用于含细菌量较多的粪便等标本的接种方法是答疑编号500735120102正确答案A 可用于观察细菌动力的接种方法是答疑编号500735120103正确答案C 用于观察细菌的各种生长状态的接种方法是答疑编号500735120104正确答案D A.需氧培养法B.微需氧培养法C.二氧化碳培养法D.烛缸法E.厌氧培养法适合一般需氧和兼性厌氧菌的培养方法是答疑编号50