Aptamer技术在食品安全监测领域中的应用.ppt

Aptamer技术在食品监测领域中的应用 主讲人 第一节Aptamer技术的基本原理一 Aptamer技术的发展历程二 Aptamer技术的基本概念二 Aptamer技术的原理 第二节核酸适配体的产生一 核酸适配体的制备二 相较之于抗体的独特优点三 其他优点 第三节Aptamer技术在食品安全监测领域的应用一 检测金属离子二 检测有机小分子三 检测抗生素四 检测真菌毒素五 检测其他非法添加物 第四节Aptamer技术的应用现状一 探讨与展望二 问题与挑战 第一节Aptamer技术的基本原理 一 Aptamer技术的发展历程1989年Nobel化学奖UniversityofColorado的ThoasCach和Yale的SydneyAltaman发现了四膜虫第一类内因子和RNaseP的RNA具有催化活性 证明RNA不仅是DNA到蛋白质的信号员 而且也可以像蛋白质一样催化化学反应 引出RNA是否是生命物质起源的问题 三件事证明RNA是生命物质起源的假说 1 找到完全或主要依赖RNA进行生命活动的生物 2 如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的 痕迹 3 如果我们能从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列 前两个实现的困难较大 第三个如果对于任意给定对的粒子 包括离子 寡肽 蛋白质等 都能找出一个具有相当亲和性和特异性的RNA序列 我们就向证明 RNA起源说 迈出了一步 90年代 人们用不同分子作为target筛选了和它们特异性结合的RNA分子 并开始命名其为aptamer Papersin Science and Nature 1TuerkC GoldL 1990 Systemicevolutionofligandsbyexponentialenrichment RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase Science249 505 10 2EllingtonAD SzostakJW 1990 InvitroofRNAmoleculesthatbindspecificligands Nature346 818 22开始于生物化学 得宠于化学生物学 二 Aptamer技术的定义1 核酸适配体是一段DNA或者RNA序列 是利用体外筛选技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段 2 核酸适配体其本质是一段与靶物质具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸链 具有特异性强 稳定性好和靶分子广等特点 近年来被广泛用于食品安全检测领域 三 Aptamer技术的原理核酸分子之间可以通过碱基配对而特异性结合 但不限于此 核酸分子亦可形成多种稳定的次级结构 如茎环 发夹 假结 凸环 口袋等 与靶分子形成空间互补 通过静电作用 范德华力以及氢键等分子间作用力 而与靶分子紧密和特异性结合 第二节核酸适配体的产生 随着食品安全问题的频发 已经严重影响了消费者对于食品安全的信心 传统的食品安全检测方法包括气相色谱 液相色谱 质谱 原子吸收等 因为其灵敏度高 稳定性好被广泛地用于食品安全检测分析 但是开发简单 快速 高效食品安全检测方法仍是一项紧迫而重要的任务 在这样的背景下 Aptamer技术应运而生 一 核酸适配体的制备 核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化技术 Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment SELEX技术 筛选出来 SELEX技术是从体外一个含1015单链寡核普酸库中筛选出与靶物质结合的核酸 通过洗脱程序去除掉未与靶物质相结合的核酸 再以这些核酸为模板进行PCR扩增 随后进行下一轮筛选 通过重复的筛选与扩增 一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力 中亲和力的DNA或RNA分子相继被洗去 而与靶物质有高亲和力的核酸适配体从非常大的随机文库中分离出来 且纯度随SELEX过程的进行而增高 最后占据库的大多数 大于90 左右 SELEX技术 SELEX 指数级富集配体系统进化 技术 基本流程如下 概括为 结合分离洗脱扩增调节 图1 SELEX筛选循环过程示意图 核酸适配体被比喻为 化学抗体 但相比于传统的抗体又具有很多独特的优点 例如 a 靶分子范围非常广泛 从金属离子到有机小分子 氨基酸 蛋白质 甚至细胞 b 筛选过程不依赖于生物体 并且适配体的筛选过程无需在生理条件下进行 可以筛选出没有免疫原性或低免疫原性 甚至具有毒性的靶物质的核酸适配体 二 相较之于抗体的独特优点 c 除此之外 可以通过体外人工合成 获得成本低廉 高纯度 具有好的化学稳定性和热稳定性的核酸适配体 d 并且这些核酸适配体的末端易于修饰上各种活性基团如 氨基 磷酸基 琉基 荧光标记物 电化学标记物等 用于表面固定修饰或者检测 三 其他优点 1 具有专一性识别靶目标的特性 2 具有高的化学稳定性 可在pH2 12之间保持稳定 即使经过100 变性 在室温下也可以恢复 3 适配体可以通过折叠与去折叠捕获和释放靶目标 使得适配体修饰的表而可以重复使用 4 适配体种类的多元化进一步扩大了传感器目标分子的范围 5 适配体易于修饰 可以灵活方便地构建各种传感检测方法 第三节Aptamer技术在食品安全监测领域的应用 因其简便 高效 快捷的特点 而广泛应用于生物组装 药物递送 信号转换 基因表达调控及食品安全领域 图2 Aptamer的筛选与应用 法一 某科学家筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷 结合常数分别可达7nmo1 L和5nmol L 灵敏度高 法二 通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实现对三价砷离子的快速检验 针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子结合呈现蓝色 而带有正电荷的PDDA会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集 从而颜色由红变蓝实现比色法测定 方便 快捷 一 检测金属离子 一 砷离子 图3 Aptamer用于As3 检验 汞离子的危害 是一种高毒性并分布广泛的污染物 在鱼类及贝类中常常以甲基汞的形式存在 汞通过食物摄入后对人体的危害主要累及中枢神经系统 消化系统及肾脏 此外对呼吸系统 皮肤 血液及眼睛也有一定的影响 利用核酸适配体与铅和汞分别形成G quartet结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定 见图4 现已开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器 利用核酸适配体修饰的纳米粒子实现了对汞离子的高灵敏快速检测 检测限可达10pmol L 二 汞离子 图4 核酸适配体同时检测Hg2 和Pb2 示意图 双酚A是己知的内分泌干扰素 可以发挥雌激素的作用扰乱人体内的代谢过程 2010年 加拿大成为首个将之列为有毒物质的国家 在欧盟和加拿大 双酚A被禁止用于生产婴儿奶瓶 二 检测有机小分子 一 双酚A 双酚A检测过程如下 该方法的检测限可达0 1ng mL 特别灵敏 检测双酚A的另一种方法 此外科学家筛选出双酚A的核酸适配体 并开发了一种基于三明治结构核酸适配体的双酚A生物传感器 将一段Aptamer定在传感器表面用于对双酚A的捕获 另一段荧光标记的Aptamer通过三明治结构连接到传感器表面 通过荧光信号的强弱实现对双酚A浓度的检测 图5 Aptamer检测双酚A示意图 三聚氰胺是一种以尿素为原料生产的氮杂环有机化合物 常温下为白色单斜晶体 没有显著异味 目前主要用于木材加工 涂料 造纸等工业生产过程 但有些不法商贩将其添加到奶粉中提高 氮含量 引发了严重的食品安全事件 因此 研究一种方便 快捷 高效的检测方法尤为重要 二 三聚氰胺 图6 基于Aptamer修饰的银纳米粒子利用光散射检测三聚氰胺 可卡因增加耐药性和药物依赖 从而导致滥用 Takeuchi小组利用可卡因Aptamer与客体间的特异性结合 制备了可卡因快速检测芯片 其原理类似于对双酚A的比色法检测 三 可卡因 三 检测抗生素 近年来 基于核酸适配体检测抗生素的文献报道较多 分别涉及电化学法 比色法 表面等离子共振等方法 涉及的种类有卡那霉素 anamycir 妥布拉霉素 Tobramycir 四环素 Tetracycline 氯霉素 Chloramphenicol 链霉素 Streptomycin 新霉素 Neomycin 土霉素 Oxytetracycline 真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物 对人类和动物都有害 真菌毒素可以通过食物进入人体 引起人体急性中毒 慢性中毒 具有致畸 致癌以及致突变作用等 法一 电化学法法二 比色法法三 荧光试剂条法 四 检测真菌毒素 电化学法 它是基于Aptamer并利用信号关闭模式的电化学检测平台 实现了对赭曲霉毒素A的快速灵敏检测 首先将三种单链DNA固定在电极表面 其中一种为赭曲霉毒素A的核酸适配体 通过核酸适配体与目标物的特异性结合改变了亚甲基蓝在电极表面的电化学性质 利用金纳米粒子对信号放大 实现了对着曲霉毒素A的高灵敏快速检测 检测线可达30pg mL 比色法 它是利用未修饰的金纳米粒子实现对赭曲霉毒素A的比色法快速检测 在赭曲霉毒素A存在的情况卜 核酸适配体与赭曲霉毒素A形成了G quadruplex结构 而金纳米粒子在Mg2 的作用下发生聚集导致颜色变化 整个反应过程在5分钟内完成 检测线可达20nmo1 L 0pg mL 图7 荧光试剂条法检测赭曲霉毒素A的原理图 荧光试剂条法 孔雀石绿 malachitegreen 是一种合成的三苯基甲烷类工业染料 许多国家就将其广泛用作水产养殖业中的杀虫剂和杀菌剂 用来杀灭体外寄生虫和鱼卵中的霉菌 因孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时问长 并有致突变 致畸和致癌的危险性 故我国 美国 加拿大以及欧盟等许多国家均禁止将其作为人类食用鱼的兽药使用 孔雀石绿的核酸适配体在1999年就被发现 最近核酸适配体被作为识别元素用于鱼肉组织内的孔雀石绿的荧光检测 阿特拉津 Atrazine 在世界广泛被使用 是最常使用的农业用杀草剂之一 但它属于持久性有机污染物 不易分解 并且会从土壤中被冲刷到溪流或地下水中 在水中残留相当长的时问 有研究指出 阿特拉津会引起癌症及肿瘤 包括卵巢癌 子宫癌及淋巴腺癌等 同时也是一种干扰内分泌的毒物会造成荷尔蒙失调 进而使动物在遗传组成方面发育成错误性别 最近Sinha等通过将阿特拉津代谢过程中一段核酸适配体植入细胞中