肝糖原测定实验报告

肝糖原的提取 鉴定与定量肝糖原的提取 鉴定与定量 一 实验目的一 实验目的 1 掌握组织样品的制备方法 了解其注意事项 2 了解肝糖原提取 糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项 掌握其操作方法 3 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器 4 熟练运用溶液混匀的各种方法 视具体情况 采用合适的混匀方法 5 正确掌握溶液转移的操作 6 正确操作使用分光光度计 二 实验原理二 实验原理 一 肝糖原的提取 鉴定 糖原储存于细胞内 采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎 低浓度的三氯醋酸能使 蛋白质变性 破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质 而糖原仍稳定地保存于上清液中 从 而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来 糖原不溶于乙醇而溶于热水 故先用 95 乙醇将滤液中糖原沉淀 再溶于热水中 糖原水溶液呈乳样光泽 遇碘呈红棕色 这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色 糖原还可被酸水解为葡萄糖 利用呈色反 应和葡萄糖的还原性 可判定肝组织中糖原的存在 CuSO4十 2NaOH Na2 SO4 Cu OH 2 2Cu OH 2十 C6H12O6 2CuOH 十氧化型葡萄糖 H2O 2CuOH Cu2O 红色 H2O Cu OH 2 CuO 黑色 H2O 二 肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖 浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物 5 羟甲基呋喃甲醛 此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物 该物质在 620nm 处有最大吸收 糖含量在 10 100 g 范围内 溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成 正比 利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色 通过标准对照法 直 接比较法 即可计算出样品中糖原的含量 糖原在浓碱溶液中非常稳定 故在显色之 前 肝组织先置于浓碱中加热 以破坏其它成分 而保留肝糖原 三 材料与方法 三 材料与方法 以流程图示意 实验材料 实验材料 一 仪器 1 普通离心机 室温 100 恒温水浴箱 2 分光光度计 精度为 10mg 级电子 天平 1 2 剪刀 1 镊子 1 研钵 1 3 试管架 1 100 15 mm 试管 3 4 刻度吸量管 2mL 1 5 mL 2 1000 L 微量可调取液器 1 5 100mL 容量瓶 1 6 白瓷反应板 1 二 实验样品和试剂 1 鸡肝 2 95 乙醇 3 0 31mol L 5 三氯醋酸溶液 4 0 15mol L NaCl 溶液 5 12mol L HCl 6 12 5mol L 50 NaOH 7 碘试剂 8 班氏试剂 9 5 35mol L 30 KOH 溶液 11 标准葡萄糖液 50mg L 12 17mol L 90 H2SO4 用于制备蒽酮显色剂 13 蒽酮显色剂 称取蒽酮 0 20g 用 17mol L H2SO4溶解至 100 mL 此试剂不 稳定 以当日配制为宜 冰箱保存可用 4 5d 实验方法 实验方法 吸取 1mL 量溶液时使用可调微量取液器 吸取 1mL 以上量溶液时使用刻度吸量 管 1 肝糖原的提取与鉴定 操作流程如下 鸡肝约 1 0g 剪碎 5 CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 5 CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中 离心 3 分钟 4000 r min 沉淀 弃去 上清 取 2 ml 2ml 95 乙醇 混匀 静置 10 分钟 离心 5 分钟 4000 r min 上清 弃去 沉淀 蒸镏水 1 ml 沸水浴 2 分钟 溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液 1ml 浓 HCl 5 滴 加碘试剂 2 滴 加碘试剂 2 滴 沸水浴 15 分钟 冷却 糖原溶液 2 滴 50 NaOH 5 滴 呈色对比 糖原水解液 2 滴 糖原水解液 班氏试剂 4 滴 混匀 沸水浴 2 分钟 观察变化 注意事项注意事项 1 肝糖原提取一步 向上清液中加入 95 乙醇后 务必注意混匀 由于上清液为 水溶液 比重大于 95 乙醇 溶液分成两层 总量相对较多 混匀操作比较困难 最 好用倾倒混匀 也可用滴管或吸量管吸 吹混匀 或用玻璃棒搅拌混匀 2 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关 葡萄糖残 基在 20 个以下的会使碘呈现红色 20 30 个之间使碘呈现紫色 60 个以上的会使碘 呈现蓝色 淀粉中分枝链较长 故呈蓝色 而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20 个以下 通常 8 12 个葡萄糖残基 吸附碘后呈现红棕色 3 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步 加班氏试剂不能过量 否则反应液呈黑色浑 浊 观察不到应有的结果 2 肝糖原定量测定 操作流程如下 鸡肝 0 10 g 30 KOH 1 5ml 用吸量管 沸水浴 15 分钟 冷却 全部转入 100 ml 容量瓶中 加水至标线 仔细混匀 此为糖原提取液 糖原的测定 取 3 支试管 按下表操作 试剂 ml 空白管标准管样品管 蒸馏水 1 0 标准葡萄糖溶液 1 0 糖原提取液 1 0 0 2 蒽酮溶液 用吸量管 2 52 52 5 混匀 沸水浴 10 分钟 冷却 在分光光度计 620 nm 波长处 用空白管溶液调零 测 定各管溶液的吸光度 A 计算 A样品100100 肝糖原 g 100 g 肝组织 A标准 0 05 肝组织重 g 1000 1 11 四 结果与讨论 四 结果与讨论 结果 实验数据 现象 图谱 讨论 以结果为基础的逻辑 推论 并得出结论 一 结果 一 结果 1 鉴定实验中的呈色对比 1 结果 2 结论 如图所示 加入提取的糖原溶液后 颜色变浅 碘液稀释后变浅 但并未 变成红棕色 所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在 2 鉴定实验中葡萄糖还原反应 1 结果 2 结论 水浴后 溶液的颜色加深 但并未生成红黄色沉淀 所以用这种鉴定方法鉴 定不出有糖原的存在 3 肝糖原定量测定实验 1 结果 定量实验中沸水浴后空白管 标准管和样品管的颜色 从左至右 吸光度测定结果 吸光度 A 空白管标准管样品管 第一次 第二次 第三次 平均 2 结论 A 样品100100 肝糖