蜂毒素溶血过程及溶血作用的生化机理研究

第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛 作品名称：蜂毒素溶血过程及溶血作用的生化机理研究 学校全称： 华 南 农 业 大 学 申报者姓名： 李 日 清 类别：自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类27蜂毒素溶血过程及溶血生化机理研究作者：李日清，林先丰，陈柏刚指导老师：赵亚华 教授（华南农业大学生命科学学院，广州，510642）摘 要：观察了蜂毒素溶血过程并研究了其溶血作用的生化机理。 1）以荧光素FITC标记的蜂毒素作用于红细胞，用激光共聚焦扫描显微镜观察，发现蜂毒素迅速包围红细胞，吸附到细胞表面，该过程可能由静电作用介导。10min后细胞表面从圆盘边缘部位开始破损，破损程度和蜂毒素浓度与红细胞浓度的比值相关，达到一定比值时红细胞完全裂解。低浓度蜂毒素处理的红细胞，在扫描电镜下呈凹陷不规则形状，表面褶皱粗糙。 2）以SPQ为荧光探针测定蜂毒素作用下带3蛋白阴离子转运活性，结果显示转运活性比正常情况增加1倍以上。推测蜂毒素C端吸附带3蛋白负电荷糖化基，N端影响带3 跨膜域疏水区及膜脂流动性，促使阴离子转运活性显著增强，引起红细胞内环境酸化。 3）采用钼蓝法测定Na+/K+-ATPase活性。在蜂毒素附着血红细胞质膜或游离于反应溶液的反应条件下，Na+/K+-ATPase活性均受到抑制，后者的抑制可通过加入EDTA得到部分解除。 蜂毒素一方面插入质膜促使Na+/K+-ATPase二聚体解离，破坏酶结构，另一方面通过正电荷残基（Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24）与ATP产生静电吸引，跟Na+/ K+-ATPase竞争底物，抑制其活性，从而引起红细胞内离子环境失衡。 4）分光光度计测定G-6-PD活性，发现蜂毒素抑制G-6-PD活性，当其浓度达到或大于10mol/L时强烈抑制，加入EDTA可迅速解除部分抑制。反应启动前和反应启动时两个时刻加入蜂毒素，G-6-PD活性无明显差异，说明蜂毒素对G-6-PD二聚体无破坏作用。底物G-6-P或辅酶NADP与蜂毒素混合后加入反应系统均出现G-6-PD活性检出滞后现象，表明蜂毒素与G-6-P及NADP都具有亲和性，它是通过与G-6-PD竞争底物及辅酶来抑制G-6-PD活性的。蜂毒素抑制G-6-PD活性从而阻碍红细胞HMP途径，损害红细胞还原系统。关键词： 蜂毒素 膜活性 溶血活性 带3蛋白 G-6-PD Na+/K+-ATPaseMelittin-induced hemolytic Process and the Study of biochemical Mechanism of Hemolysis induced by MelittinAuthor: Riqing Li, Xianfeng Lin, Baigang ChenDirector teacher: Yahua Zhao(South China Agricultural University, College of Life Science, GuangZhou, 510642)Abstract: Melittin-induced hemolytic process was observed, then its biochemical mechanism was studied. 1) The treatment of erythrocytes with FITC-marked melittin, as observed by laser confocal scan microscope, showed that melittin surrounded and adsorbed the surface of erythrocytes quickly, which might be induced by static gravitation. The verge of cellular surface began to stave in 10min, and the degree of this process was related to the ratio of concentrations of melittin and erythrocytes. Erythrocytes collapsed when the ratio reached to a given value. As observed by scanning electron microscope, erythrocytes appeared lacunose and coarse after they were disposed with melittin with low concentration. 2) By measuring anion transport activity of band 3 with SPQ, its showed the activity was enhanced over two folds than the normal level. A mechanism is proposed that melittin adsorbs glycated groups of band 3 by its C-terminus, and influences hydrophobic region of transmenbrane domain of band 3 and lipid fluidity of plasma membrane by its N-terminus, then enhances anion transport activity, which induces inner acidification of erythrocytes. 3) Measuring Na+/K+-ATPase activity by Molybdenum-blue Spectrophotometry showed that the activity of Na+/K+-ATPase was restrained when melittin targeted to the plasma membrane of erythrocytes or when melittin was dissociative, and the latter restraining was weakened when EDTA was added to the reaction. Melittin can inserts the plasma membrane of erythrocytes, which leads to the breakage of Na+/K+-ATPase. On the other hand, melittin statically attracts ATP and restrains the activity of Na+/K+-ATPase. The restraining will break cellular ion balance. 4) Measuring G-6-PD activity by a spectrophotometer showed that the activity of G-6-PD was restrained seriously when the concentration of melittin was 10mol/L or higher. However, this restraining effect was reduced in the presence of EDTA. Melittin did not damage the dimmer configuration of G-6-PD. A lag of activity mensuration was observed when a pre-mixture of G-6-P or NADP with melittin was set in the reaction system. This demonstrates that there is affinity between melittin and G-6-P and NADP separately, and melittin restrains the G-6-PD activity by competing G-6-P and NADP. The restraining checks cellular HMP, and damages the ability of deoxidization of erythrocytes.Key words: melittin membrane activity hemolysis activity band 3 proteinNa+/K+-ATPase G-6-PD 蜂毒素（melittin）是一种由26个氨基酸残基组成的两亲性螺旋抗菌肽（antimicrobial peptide）分子，是蜂毒（bee venom）中的主要成分，其分子量为2840D。蜂毒素具有极强的广谱抗菌消炎活性，能结合到磷脂膜上，裂解各种类型的细胞和脂质体，还有抗癌、抗电离辐射的功能1，以及有抗艾滋病毒的作用2。随着传统抗生素广泛使用，出现了细菌耐药性，耐药菌株愈来愈多，甚至出现能对抗所有抗生素的耐药菌3,4。研发具有抗耐药菌的新一代抗生素已经是迫切的课题。抗菌肽通过作用于细菌细胞膜而抑制或杀死细菌，不易诱发细菌耐药性，而有望替代传统抗生素成为新一代抗生素5。蜂毒素因其生物活性高，且结构特殊，已经成为生物学界研究这类抗菌物质的模式材料。然而蜂毒素具有溶血副作用，极大地限制了其在医药方面的应用。在蜂毒素抗菌机制和溶血机理研究的基础上，通过生化或基因工程手段改造蜂毒素分子以保留其抗菌活性和消除其溶血活性已成为研究热点6,7。蜂毒素的溶血机理的研究是其分子改造的理论基础。目前主要通过蜂毒素与脂质体、合成磷脂双层膜或天然质膜的作用关系来研究其溶血机理。研究认为蜂毒素溶血活性主要是基于穿孔机制8,9。但是蜂毒素与红细胞膜上以及细胞内重要酶的作用关系目前还没有深入研究，使得蜂毒素溶血机理尚不完备。笔者通过激光共聚焦扫描显微镜直接观察蜂毒素的溶血过程，进而研究蜂毒素对红细胞膜上和胞质重要酶的生化作用关系，从而全面阐述蜂毒素溶血机理，探索其溶血活性的生化基础，为蜂毒素分子改造、溶血活性消除提供理论依据。带3蛋白是红细胞整合蛋白，在红细胞膜骨架形成和稳定中起重要作用。同时具有介导Cl/HCO3离子交换的活性，维持红细胞内环境pH值稳定。钠钾ATP酶（Na+/K+-ATPase）是红细胞膜上重要的ATP酶，维持红细胞的渗透性和静息电位、保持细胞体积及可塑性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）是磷酸戊糖途径(HMP)的限速酶，能催化产生红细胞还原当量NADPH，从而保护红细胞免受氧化损伤。这些蛋白和酶在血红细胞稳定及避免溶血中起着关键作用。研究蜂毒素对带3蛋白、Na+/K+-ATPase和G-6-PD的作用机理将有助于蜂毒素溶血机理的阐明。1 材料与方法1.1 材料新鲜肝素（Heparin）抗凝鸡血（每100mL血液加入20mg肝素）。Melittin、Heparin、FITC、SPQ、G-6-P、NADP、Ouabain、ATP-Na2均为Sigma公司产品。戊二醛、锇酸由华南农业大学测试中心电镜室提供。其他试剂为国产分析纯。1.2 方法 1.2.1 红细胞悬液的制备 新鲜的肝素抗凝鸡血，4 3000rpm 离心20min得到积压红细胞，以4预冷生理盐水洗涤3次，悬浮，制成5红细胞悬液，4保存（可稳定一周）。1.2.2 溶血素的制备 取10mL 5%红细胞悬液，4 5000rpm离心10min，去上清，沉淀用9.5mL 4预冷双蒸水（每100mL加入5L -巯基乙醇）溶解，即可得到1 : 20溶血素，4保存（不宜超过8h）。1.2.3 红细胞膜的制备按文献10中的方法制备红细胞膜，用0.75mmol/L蔗糖制成膜制剂溶液，用改良Lowry法测定蛋白浓度，-20贮藏。1.2.4 激光共聚焦扫描显微镜观察蜂毒素溶血过程40L 35mol/L蜂毒素溶液加入1L 1FITC溶液（丙酮做溶剂），混匀，25避光标记2h。取其中10L加到60L 5红细胞悬液中，涂布于鸡蛋清处理过的载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察，ex=492nm，enm=518nm，每15S扫描一次。1.2.5 扫描电镜观察蜂毒素处理后红细胞1mL 5%红细胞悬液加入30L蜂毒素溶液，混合，37水浴10min，1500rpm离心10min，弃上清，沉淀以等渗PBS洗3次。4%戊二醛溶液固定过夜，等渗PBS洗3次。1500rpm离心2min，沉淀以1%锇酸固定1h，70%乙醇洗3次。1500rpm离心2min，沉淀上台点样，CO2干燥，真空喷金。（以上步骤均在4下进行。）样品在扫描电镜下观察拍照。1.2.6 带3蛋白阴离子转运活性测定采用文献11报道的方法。红细胞以低渗法转载SPQ荧光探针后，重悬于等渗溶液中（红细胞浓度2%），加入蜂毒素（终浓度0.4mol/L），用F-4500型荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长=320nm，发射波长=445nm，每5min记数一次。1.2.7 Na+/K+-ATPase活性的测定以500mol/L KH2PO4为标准溶液，测定、绘制D660nm值与磷（Pi）浓度关系的标准曲线。Na+/K+-ATPase活性参考文献12报道的方法测定，以有和无Ouabain条件下水解ATP生成Pi的量的差值来表征。各组试验经三次平行测定，取平均值。1.2.8 G-6-PD活性的测定按文献13中的方法测定。蜂毒素与底物G-6-P或辅酶NADP混合加入反应体系以启动反应。各组试验均经三次平行重复，取平均值。2 结果与分析2.1 蜂毒素的溶血过程荧光探针FITC标记蜂毒素在ex = 492nm条件下发射绿色荧光。将FITC标记蜂毒素加入红细胞悬液中，激光共聚焦扫描显微镜下动态观察蜂毒素与红细胞的作用过程和程度。FITC标记蜂毒素浓度为5mol/L（可完全溶血）时，看到蜂毒素迅速聚集到红细胞周围，附着细胞表面，使红细胞呈现略黑的圆盘状。圆盘边缘附着蜂毒素最为密集（见图1）。10min后，红细胞圆盘边缘附着蜂毒素部位呈小碎片脱落，红细胞逐渐变薄、变亮。接着细胞边缘开始破损，裂解，并逐渐向细胞中央发展，直至细胞成为碎片状残骸。该过程在2min内完成。细胞裂解程度与蜂毒素浓度相关，降低加入蜂毒素的浓度时（10mol/L），e引发活性滞后（形成四聚体），而d由于存在EDTA没有出现活性检出滞后，表明EDTA抑制melittin聚集形成四聚体。表3 梯度浓度melittin与EDTA对G-6-PD活性的作用Table 3 Effects of G-6-PD activity caused by melittin with concentration grads and EDTA体系试剂(L)defgh1mol/L Tris-HCl(pH7.4)30303030305mmol/L EDTA302mmol/L NADP30303030301mmol/L MgCl2303030303035mol/L melittin10010057100198100mmol/L G-6-P1212121212蒸馏水689814198 混匀，37水浴预热体系中d、e、f、g、h的melittin浓度依次为11.7mol/L、11.7mol/L、6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L。d组含EDTA，其他组不含EDTA。d、e、f、g、h的Tris-HCl、 NADP、Mg+浓度与体系d、e、f、g、h是一致的。 In I system, melittin concentration of d、e、f、g、h were 11.7mol/L、11.7mol/L、6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L, respectively。d contained EDTA, and the others contained no.体系试剂(L)defgh1mol/L Tris-HCl(pH7.4)1701701701701705mmol/L EDTA1701702mmol/L NADP1701701701701701mmol/L MgCl21701701701701701:20溶血素4040404040蒸馏水980980115011501150 37温育10min体系试剂加于石英比色杯中。体系d、e、f、g、h分别加到d、e、f、g、h中启动反应（体系不含底物G-6-P，而体系含G-6-P，体系加到体系后启动反应）， 此时d、e、f、g、h各反应体系中melittin的终浓度为：1.76mol/L、1.76mol/L、1.00mol/L、1.76mol/L、3.52mol/L。 In the system, all reagents were added in the respective quartz cup. d、e、f、g、h added in d、e、f、g、h separately and relevant reactions were started, when the melittin concentration of d、e、f、g、hwere 1.76mol/L、1.76mol/L、1.00mol/L、1.76mol/L、3.52mol/L, respectively.图8 梯度浓度melittin及EDTA对G-6-PD活性的作用d、e含EDTA，反应启动前melittin浓度为11.7mol/L；f、g、h不含EDTA，反应启动前melittin浓度分别为6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L。 Fig. 8 Effects of G-6-PD activiry caused by melittin with concentration grads and EDTAd、econtained EDTA, the melittin concentration was 11.7mol/L；f、g、hcontained no EDTA, the melittin concentration were 6.65mol/L、11.7mol/L、23.4mol/L, respectively.G-6-PD活性检出滞后延续较短的时间，G-6-P与melittin混合液加入反应体系后，随melittin浓度降低（比如表3中d组，浓度从11.7mol/L变为1.76mol/L）四聚体解体，活性检出滞后消失，G-6-PD进入平缓稳定的抑制期，表明melittin的不同结构形态（四聚体与单体）对G-6-P的相互作用差异悬殊。将表2中2mmol/L NADP和6mmol/L G-6-P位置对换，6mmol/LG-6-P与35mol/L melittin混合液改为2mmol/L NADP与35mol/L melittin混合液（即由NADP或者NADP与melittin混合液来启动反应），进行表2的操作，结果出现跟图7类似的现象（见图9，曲线a、b、c对应表2的 a、b、c）。 a、b、c斜率分别低于a、b、c，b的活性检出滞后时间约1.5min，略小于b（约2min）。可见G-6-P及NADP与melittin的作用关系是相同的。G-6-P、NADP、EDTA、melittin的分子结构如图10所示。G-6-P、NADP和EDTA的共同特点是带有带负电荷的基团（磷酸基团和羧基）。Melittin肽链中Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24等5个残基带正电荷，聚集为四聚体时，形成疏水中心，亲水面向外，正电荷均匀分布在四聚体分子周围25。推测G-6-P、NADP与melittin的相互作用是由磷酸基团与melittin正电残基的静电作用引起的。Melittin单体（无规则卷曲肽链）的正电荷无序而分散，四聚体的形成使得正电荷集中且均匀地分布，造成四聚体和单体对G-6-P和NADP的作用差异明显。EDTA以四个空间分布特殊的羧基，阻止melittin聚集形成四聚体，同时削弱了其与G-6-P和NADP的静电作用。G-6-PD正常反应曲线、反应体系加入melittin或melittin与EDTA混合液时的反应曲线（见图11），与以上推测相吻合。图9 以辅酶启动发应时G-6-PD催化NADPH生成速率随时间的变化a：以NADP启动反应；b：以melittin与NADP混合液启动反应；c：melittin和NADP分开，但同时加入反应体系，启动反应。 Fig.9 Velocity of NADPH forming catalyzed by G-6-PD when the reaction are start with NADPa: reaction started with NADP; b: reaction started with the mixture of melittin and NADP; c: melittin and NADP were disjoined, but added in at the same time.图10 G-6-P、NADP、EDTA、ATP、melittin分子结构Fig.10 The molecular structures of G-6-P、NADP、EDTA、ATP and melittin图11 EDTA对G-6-PD活性的影响i：正常反应（不含melittin）； j：加入2mol/L melittin和0.5mmol/L EDTA；k：加入2mol/L melittin。Fig.11 The G-6-PD activity effected by EDTAi: contained no melittin; j: contained 2mol/L melittin and 0.5mmol/L EDTA; k: contained 2mol/L melittin. 以2mol/L melittin处理溶血素（含G-6-PD）30min后启动反应，与不经melittin处理而在启动反应时加入2mol/L melittin，两种反应条件下的G-6-PD活性没有明显差异（见图12），表明melittin不会损伤G-6-PD二聚体，而是通过与其底物（G-6-P）及辅酶（NADP）的静电作用来抑制G-6-PD。 图12 melittin对G-6-PD二聚体的影响m： 2mol/L melittin处理G-6-PD 30min后启动反应； n： 不经melittin处理而在启动反应时加入2mol/L melittin。 Fig.12 The effect of melittin on G-6-PD dimmer formation m: 2mol/L melittin was added 30 min before the start of reaction; n: 2mol/L melittin was added at the time the reaction started. G-6-PD存在辅酶结合位点和底物结合位点，辅酶结合位点与辅酶NADP亲和作用极强，极低NADP浓度下即可反应，NADP的浓度变化对G-6-PD活性影响不明显；底物结合位点对G-6-P亲和性较弱，G-6-P浓度降低时G-6-PD活性下降显著。在NADP为40mol/L的情况下，若G-6-P浓度从600mol/L下降至250mol/L，G-6-PD活性则减少53.6。melittin静电吸引G-6-P，降低溶液中G-6-P浓度而影响G-6-PD活性。在血红细胞内，NADP/ NADPH=1/71，NADPH稳定浓度为65mol/L，NADP浓度约为1mol/L26，G-6-P浓度为83mol/L27，由于在红细胞内环境中NADP、G-6-P浓度很低，1mol/L melittin将几乎完全抑制G-6-PD的活性。3 结 论蜂毒素溶血过程里，蜂毒素分子首先迅速聚集并吸附在红细胞表面周围，推测该过程由蜂毒素C端正电荷残基密集部位与红细胞带3蛋白以及血影蛋白负电荷糖化基之间的静电作用引起。吸附红细胞表面的蜂毒素经过10min的作用过程，引发红细胞圆盘边缘开始破损、脱落。破损程度和蜂毒素浓度及红细胞浓度的比值相关，达到一定比值时红细胞被裂解。低浓度蜂毒素使红细胞膜受到一定程度的损害，细胞内外渗透平衡打破，使红细胞凹陷、不规则形状，表面粗糙。这与红细胞带3蛋白及Na+/K+-ATPase活性受到蜂毒素影响相关。蜂毒素可能通过正电荷残基密集的C端与带3蛋白负电荷糖化基作用，同时疏水N端引起带3蛋白结构以及其周围膜脂流动性变化，促使带3蛋白阴离子转运活性显著增加，Cl出胞、HCO3入胞过程得以加速，将影响红细胞CO2运转和排出功能，同时引起细胞内pH值迅速降低。Melittin以其膜活性破坏血红细胞质膜完整性，从而间接破坏Na+/K+-ATPase活性，同时也通过与底物ATP的静电作用直接抑制Na+/K+-ATPase的酶活。ATP是红细胞内的供能分子，melittin的作用将影响ATP参与的代谢反应，对红细胞代谢产生广泛的干扰（见图10）。Melittin对G-6-PD的抑制作用基于其与辅酶NADP及底物G-6-P的静电作用（G-6-P、NADP的负电荷磷酸基团与melittin的正电荷氨基酸残基），而对G-6-PD二聚体没有直接的损害。当melittin从无规则卷曲单体聚集形成四聚体时，由于正电荷排布的均匀及有序化，对G-6-P及NADP的亲和发生急剧变化。细胞内NADP的稳定浓度为1mol/L 26 ，低浓度melittin将几乎完全抑制G-6-PD的活性，中断红细胞HMP途径，胞内还原系统受到抑制，红细胞于是容易受到强氧化性分子的攻击而使细胞膜受损，诱发溶血。G-6-P既是G-6-PD的底物，也是血红细胞糖酵解（EMP）中的关键性中间产物，melittin与G-6-P的作用干扰EMP途径，造成细胞内代谢干扰。EDTA存在四个空间分布特殊的羧基，阻止melittin聚集形成四聚体，同时也削弱melittin与NADP、G-6-P、ATP等分子的静电作用。EDTA可作为melittin结构机理研究的一种工具性试剂。参考文献1 Zhao YH, Liu AS, Li RQ, et al. 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