[生物医药论文精品]丹酚酸b的水解动力学及降解机理

丹酚酸B的水解动力学及降解机理摘要目的研究丹酚酸B的水解动力学特征和降解机理。方法运用HPLC定量分析丹酚酸B，运用LCMS及NMR检测丹酚酸B的水解产物，推测其降解途径。结果丹酚酸B降解符合一级动力学特征，降解速率随缓冲盐浓度的增加，温度的升高而加快，PH速率图是“S”型曲线，在PH20时最为稳定。1H13CNMR鉴定结果表明，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、紫草酸和紫草酸异构体等是丹酚酸B的降解产物。结论得出了丹酚酸B的水解动力学特征，初步推断了丹酚酸B的降解机理。关键词丹酚酸B；水解；动力学；降解机理；LC/MSHYDROLYSISKINETICSANDDEGRADATIONMECHANISMOFLITHOSPERMICACIDBABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEKINETICSANDMECHANISMOFDEGRADATIONOFLITHOSPERMICACIDBLABINAQUEOUSSOLUTIONMETHODSHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYHPLC,LIQUIDCHROMATOGRAPHYMASSSPECTROMETRYLCMSANDNUCLEARMAGNETICRESONANCENMRWEREEMPLOYEDRESULTSTHEDEGRADATIONFOLLOWSPSEUDOFIRSTORDERKINETICSUNDERALLEXPERIMENTALCONDITIONSTHERESULTSINDICATEDTHATTHEDEGRADATIONRATEINCREASEDWITHTHEINCREASEOFBUFFERCONCENTRATIONANDTEMPERATURETHEPHRATEPROFILESHOWSACHARACTERISTICSSHAPE,ANDTHEMAXIMUMSTABILITYWASOBTAINEDATPH20SIXDEGRADATIONPRODUCTSINCLUDINGDANSHENSU,PROTOCATECHUICALDEHYDE,CAFFEICACID,SAVIANOLICACIDE,LITHOSPERMICACIDANDITSISOMERIWERESEPARATEDANDIDENTIFIEDBY1H13CNMRANALYSISCONCLUSIONTHECHARACTERSOFKINETICSANDMECHANISMOFDEGRADATIONOFLABINAQUEOUSSOLUTIONWERESTUDIEDTHEPRIMARYDEGRADATIONPATHWAYOFLABISPROPOSEDKEYWORDSLITHOSPERMICACIDBHYDROLYSISKINETICSREACTIONMECHANISMLC/MS丹参是唇形科植物丹参SALVIAMILTIORRHIZABGE的干燥根及根茎，是味传统中药，具有“袪瘀止痛，活血通经、清心除烦”等功效1。丹酚酸B是丹参的主要水溶性成分，含量G1028G4512G708G2356干G18337的28，G13434G2356丹参中G5647酚酸G17148量的54G709，在G6251G8699G2282、清除G14270G11013G3534、G1457G6264心G14053血G12661G13582血G1889G9760G8892G6451G1272G7053G19766有G17751G5390的G10995物活性2,3。G1186分G4388结构G990G11487，丹酚酸B是G11013G1016分G4388丹参素和一G1022分G4388咖啡酸G1120G13870体G1209G18243G19202G13565合而成的G1314G13870物，在水溶G9094中G993稳定。G10591G1976G136664等在研究G7691G2709G3800理G7053G8873G4557丹酚酸B的G5445G2721时G2469G10628用G5506G8844的水G6564G2474丹酚酸B时，其含量G1820增G3835G2530降G1314。G1534力G19034,5等在研究加G9921G7053G5347G4557G13565合酚酸G5445G2721时，G2469G10628丹酚酸BG4557温度G5468G6947G5875，加G9921G7053G5347G993G2528，G6564G2474G9094中丹酚酸B的含量G11468G50581G1505G1209G990。G5364G19036等研究G2469G10628丹酚酸BG993G1177G4557温度G6947G5875，G17836G4557PHG6947G5875，丹酚酸B在PH2时G8616G17751稳定，在PH12时G11713时G19400G1881G4613G17817速G9052G3845。曲G7702G85067等研究了G993G2528G9167加G2070G4557水溶G9094中丹参酚酸B的G5445G2721，结果表明，酸性G9167加G2070G4557溶G9094中丹酚酸B的G1457G6264G1328用明G7186G3921G1122G11909性G6122中性G9167加G2070,其中G1209G6251G3363血酸的G1457G6264效果最G1351。G11013G8504G2499G11705，G5445G2721丹酚酸BG9921稳定的G3252素主要是温度和PH。G1306G2052G11458G2081为止，G7422G16277有G1863丹酚酸B降解G16280G5471及其降解途径的G6265G17959。G7424G7003G1209物理药G2070学中G2465G5224动力学和G9921为学为理G16782G3534G11796，G1209HPLC，LCMS和NMR为分析G6175G8585，G13007统研究了丹酚酸B在高温加速G4466G20576G7477G1226G991的水解动力学特征与降解机理。1材料与方法11主要仪器与试剂高效G9094G11468色谱仪G708AGILENT1100G13007列G709。TSQ三级四极杆G17148谱仪G708FINNIGANG709。半制备型高效G9094G11468色谱G708岛津G708SHIMADZUG709LC6ADG709。图1丹酚酸B的分G4388结构G708分G4388G5347C36H30O16，分G4388量718G709FIG1STRUCTUREOFLABMFC36H30O16,MW718分析LCMSG708WATERS2690分离单元，WATERS996G1120极G12661阵列检测器，WATERSMILLENNIUM32色谱工G1328站，FINNIGANTSQ三级四级杆G17148谱仪，HYPERSILAAODS色谱柱G709。核磁共振仪G708BRUKER400HZG709甲醇、乙腈G708色谱纯，TEDIAG709。其它试G2070均为分析纯，水为MILLIPORE制备超纯水。丹参G708河北省安国县丹参药材G3534地G709。丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B标准G2709G708含量均G993G1314G1122985，中国药G2709G10995物制G2709检定所G709。12HPLC分析方法色谱柱HYPERSILAAODSC8150MM46MM,5M；柱温箱温度30OC；检测波长为288NM；洗脱流速为10ML/MIN；进G7691量是10L；流动G11468G11013A1V/V，醋酸水溶G9094和B乙腈甲醇32,V/V组成，梯度洗脱程序G16277表1。13HPLCESI/MS分析方法色谱G7477G1226G2528G990，ESI离G4388源M/Z扫描范围为1201200；扫描周期是1S；离G4388喷雾电压选择45KV；毛细G12661温度是325；夹套气G708N2G709流量为40PSI；辅助气G708N2G709流速是20ARBITARYUNITS；检测G7053G5347选择负离G4388检测。14丹酚酸B水解过程G1209丹参制G2474含量为70的丹酚酸BG7691G2709，称G7691G2709100MG，用PH20的去离G4388水定容G112210ML的容量瓶中，G1457存在4冰箱中。每次G4466G20576时，G247440L加入G2052装有960LG11468G5224缓冲溶G9094的G2465G5224器中，密封，9005的恒温加G9921。根据预G2465G5224结果，当G2465G5224物浓度G991降为原浓度G1343410时，G2474出40L，G17817速冷却G1209中止G2465G5224，冰中G1457存，在6HG1881进G769110L分析。15离子强度对反应速率的影响根据碰撞理G16782，凡在溶G9094中进行的G2465G5224会受G2052离G4388G5390度的G5445G2721。为了排除G11013表1梯度洗脱表TAB1GRADIENTPROGRAMOFTHEMOBILEPHASEG1122离G4388G5390度G993G2528给G2465G5224速率造成的G5445G2721，用NACL调节离G4388G5390度G205205M。16PH和缓冲盐对反应速率的影响为了维持G11468G4557稳定的PH，水解G4466G20576是在缓冲溶G9094中进行的。G4466G20576中选择了醋酸盐和磷酸盐缓冲溶G9094，在PH04127用HCLNACL；PH230用H3PO4NAH2PO4；PH3555用HACNAAC；PH6070用NA2HPO4NAH2PO4。为了正确判断PHG4557丹酚酸B降解速率的G5445G2721，首G1820要排除缓冲盐的G5445G2721。在每G1022PHG991，测定三G1022缓冲盐浓度G7080048，0096，0192MG709G991的速率常数。17温度对反应速率的影响G4466G20576中其它G7477G1226G1457持一定的情况G991，在PH093和20G1016点考察了温度G5445G2721，为了G1457证用ARRHENIUSG7053程外推的正确性，G4466G20576中选择的温度范围G8616G17751宽，包G633650、60、70、80和90。2结果与分析21丹酚酸B的水解G4557G1122一级G2465G5224，有G1209G991特征TKCCOBST0LNG3G6122LN10TOBSCCTKG7081G709其中，C0,CT分G2047是G2465G5224G17227G3999时G2063与T时G2063的G2465G5224物浓度，T为G2465G5224时G19400，KOBS为G2465G5224速率常数。丹酚酸B的浓度G5647是随G11540水解时G19400G2588G6363数性G991降，G2588G10628出一级G2465G5224的特征。G1186丹酚酸B的G17227G3999浓度C0和T时G2063的浓度CTG2499G1209G12651出丹酚酸B的降解速率常数KOBS，一级G2465G5224的G2490一G18337要特征是速率常数的量G13446为G708时G19400G7091。G4557丹酚酸B降解G4466G20576的所有数据用G1856G53471进行G6323合，G2469G10628丹酚酸B的浓度G2109G1325率的G14270G9994G4557数LNCT/C0和时G19400存在G14403G3921的线性G1863G13007，G11468G1863G13007数均G3835G1122095。G18108分一级动力曲线G16277图2。G1186图2G2499G11705，在浓度为005MOL/L的缓冲盐溶G9094中，丹酚酸B在G993G2528PHG991的降解均符合一级动力学特征。22缓冲盐浓度对反应速率的影响丹酚酸B的降解速率随缓冲盐浓度的G2476G2282情况G16277图3。G1186图3G2499G11705，G7092G16782在磷酸缓冲溶G9094中FIG3A，G17836是在醋酸缓冲溶G9094中FIG3B，G2465G5224速率常数KOBS均随G11540缓冲盐的浓度增G3835而增G3835。23PH对反应速率的影响G4557G1122一G1022G9094体制G2070而G16340，PH是G5445G2721药物降解速率的G18337要G3252素G1055一，G1075是药物稳定性研究中G1863G8892G17751G3822的一G1022参数。G17837G12879G2465G5224的G2465G5224速率常数G2499用G1209G991G1856G5347G7481表G12046KOBSKPHKBBG7082G709其中，常数KOBS是丹酚酸B降解的表G16278速率常数，KPH是特G8542酸G11909G1664G2282速率常数，KB是一G14336G1664G2282G2070的G1664G2282速率常数G11013G1856G53472G2499G11705，G4557G1122一G1022PH确定的G2465G5224，图3的曲线外推G14279缓冲盐浓度为G19658时，G4613得G2052了排除缓冲盐G5445G2721的速率常数KPH，它表G12046G2465G5224G2494受特G8542酸G11909G1664G2282的速率常数。G4570一G13007列外推得G2052的速率常的LOGKPHG4557PHG13484图，G4613得G2052了G9052除缓冲盐G5445G2721的PH速率曲线图4。G1186图4G2499G11705，丹酚酸B的降解PH速率曲线符合药G2070稳定性研究中常G16277的图2G390C丹酚酸B在缓冲溶G9094中的一级动力学曲线FIG2PSEUDOFIRSTORDERPLOTSFORTHEHYDROLYSISOFLABINBUFFERSOLUTIONSAT90C图3缓冲盐浓度G4557丹酚酸BG2465G5224速率的G5445G2721A磷酸盐G708BG709醋酸盐，图中数G1552为溶G9094的PH图4G3丹酚酸B的PH速率曲线FIG4PHRATEPROFILEOFLAB“S”型曲线，而G1000在PH4560G1055G19400有一G1022“G6308”点，在PH20时，丹酚酸B最为稳定，而当PH20时，随G11540PH的增加，丹酚酸B的降解速率明G7186加快，表明G11909G1664G2282成为主要G3252素。24温度对反应速率的影响在其它G7477G1226G1457持一定的情况G991，丹酚酸B在G993G2528温度G991的降解速率G16277表2。G1186表2G2499G11705，丹酚酸B的降解速率随G11540温度升高而增G3835，为了定量描G17860G17837G12193G5445G2721，G5353入经G1868的ARRHENIUSG1856G5347RTEAKAOBSLNLNG7083G709其中A是G6363G2081G3252G4388，EA丹酚酸B降解G2465G5224的表G16278活G2282G14033，R是理G5831气体常数G7088314JMOL1K1G709,T是G13489G4557温度G4466G20576ARRHENIUS曲线G16277图5G1186图5G2499G11705，丹酚酸B的降解速率随温度升高而增G3835，在PH20时，丹酚酸B的降解速率受温度G5445G2721G11468G4557G17751G4579。G17836G2499G1209G11487出，温度G4557丹酚酸B的降解速率的G5445G2721在70CG2469G10995了G17728G6252，G17837G12193G10628G16949表明丹酚酸B降解ARRHENIUSG7053程中的G6363G2081G3252G4388A是具有温度G1393G17194性的。25丹酚酸B的水解产物丹酚酸B在90水解一定时G19400G2530的降解产物G16277图6。表2温度G4557丹酚酸B降解速率的G5445G2721TAB2EFFECTOFTEMPERATUREONRATEOFLABHYDROLYSIS图5丹酚酸B降解的ARRHENIUS曲线图FIG5ARRHENIUSPLOTSOFLABG1186图6G2499G11705，丹酚酸B的水解产物G17751G3822，用HPLC制备了6G12193含量G11468G4557G17751G3822丹酚酸B的水解产物，G5194用LCMS和NMR特G2047是G1120维谱，G1582了鉴定，它G1216分G2047是丹参素G708DANSHENSUG709、原儿茶醛G708PROCATECHUICALDEHYDEG709、咖啡酸CAFFEICACID、丹酚酸ESALVIANOLICACIDE、紫草酸LITHOSPERMICACID和紫草酸异构体ISOMEROFLITHOSPERMICACID，结构G16277图7。26丹酚酸B降解机理G7081G709G3丹酚酸E产G10995的途径丹酚酸E是丹酚酸B降解G17819程中的一G1022G18337要的中G19400产物，根据丹酚酸BG2591G2903G10627结构特性，推测丹酚酸B经酸G1664G2282、G5332G10627、脱水形成丹酚酸E，具体G17819程G3926图8。G7082G709其它水解产物产G10995机理推断出丹酚酸EG2530，结合丹酚酸B、E的G18243G19202结构，推断其它产物产物产G10995机理G3926图9。G1186图9G2499G11705，丹酚酸B是通G17819G18243水解和G14531G5194G2591G2903G10627G5332G10627G2465G5224进行降解。G5647的G7481G16840，丹酚酸B主要G2465G5224G1313点有3G3800，分G2047是2G1022G18243G19202与1G1022G2591G2903G10627；主要G2465G5224G12879型是G2591G2903G10627G5332G10627和G18243水解。图6丹酚酸B及其水解产物的HPLCFIG6HPLCOFSALVIANOLICANDITSHYDROLYSISPRODUCTS图7丹酚酸B及其降解产物FIG7LITHOSPERMICACIDBANDITSDEGRADEDPRODUCTS图8丹酚酸E的产G10995机理FIG8PROPOSEDFORMATIONPATHWAYOFSALVIANOLICACIDEFROMSALVIANOLICACIDB图9丹酚酸B的降解途径FIG9THEDEGRADATIONPATHWAYOFLAB3讨论丹酚酸B的降解符合一级动力学特征，其降解速率受G991列G3252素G5445G2721丹酚酸B的降解速率随缓冲盐浓度的增加而增G3835，随G11540温度的升高而加快。溶G9094PH是G5445G2721丹酚酸B降解的最主要G3252素，丹酚酸B的PH速率曲线是G5114有“G6308点”的“S”型曲线。G4557PH速率曲线的G6323合结果表明，丹酚酸B的在PH2时最为稳定，PH2时，丹酚酸B的降解速率随G11540PH的增G3835而增G3835。G3G3252G8504，丹酚酸G37G6564G2474G17819程中G4464G13565G11713受G9921时G19400，G5194G6523制G6564G2474G9094G83G43。丹酚酸B降解G2465G5224是一G1022G3809G7446的G2465G5224体G13007，G1209丹酚酸B为G2465G5224物有3G1022G5191行G2465G5224，每G1022G2465G5224G2460包含G3822级G17842G1030G2465G5224，在一定时G19400G1881，中G19400产物G14033G17810G2052一定程度的G5191G15925，存在G3822G12193物G17148G1055G19400的单G2533G17728G2282。G5647的G17247G2195是丹酚酸B，丹酚酸E、紫草酸及其异构体的含量在G991降，而丹参素、咖啡酸和原儿茶醛含量在G993断增加。G3252G8504，G4557丹酚酸B为主的制G2070，G5224G13864合G6523制丹酚酸B含量G991G19492和丹参素、原儿茶醛含量G990G19492，G1209G1852G19766G2465G7156制G2070G17148量。REFERENCESG7591G761G3NATIONALPHARMACOPOEIACOMMITTEE，PHARMACOPOEIAOFPEOPLESREPUBLICOFCHINA，VOLG7141，CHEMICALINDUSTRYPRESS,BEIJING，2005，PG71452G714G7592G761G3TG714YOKOZAWA，CHUNGHG714Y，DONGE，ETALG714CONFIRMATIONTHATMAGNESIUMLITHOSPERMATEBHASAHYDROXYLRADICALSCAVENGINGACTIONJG714TOXICOLPATHOL，199547341344G714G7593G761G3WUXG714J，WANGYG714P，WANGW，ETAL，FREERADICALSCAVENGINGANDINHIBITIONOFLIPIDPEROXIDATIONBYMAGNESIUMLITHOSPERMATEBJG714ACTAPHARMACOLSING714212000855858G714G7594G761G3WANGFG714M,LIL，LIUXG714M，ETAL，EXTRACTIONOFSALVIANOLICACIDBFROMDANSHENANDDETERMINATIONBYHPLCMETHODJG714RESEARCHANDPRACTICEOFCHINESEMEDICINES，2004,186264G714G7595G761G3NILG714J，GUHG714XG714GAOXG714JETAL，ANEWTECHNOLOGYOFETRACTINGSALVIANOLICACIDBFROMSALVIAMILTIORRHIZABUNGEJG714JOUNALOFEASTCHINAUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGYNATIONALSCIENCEEDITION，2006，08964966G714G7596G761G3NILG714J，WUKG714F，ZHANGLG714G，ETAL，INFLUENCEOFHEATINGMETHODONTHEQUALITYOFEXTRACTSFROMRADIXSALVIAEMILTIORRHIZAEJG714TRADITIONALCHINESEDRUGRESEARCHCLINICALPHARMACOLOGY，2006，1715557G714G7597G761G3ZHANGJ，WANGFG714Y，ZHANGLG714L，ETAL，INFLUENCEFACTORSONTHESTABILITYOFLITHOSPERMICACIDBINAQUEOUSSOLUTIONJG714CHINAJOURNALOFCHINESEMATERIAMEDICA，2005，3010789790G714G7598G761G3QUGG714G755，YUEXG714D，LIGG714S，INFLUENCEOFADDITIVEONTHESTABILITYOFLITHOSPERMICACIDBINAQUEOUSSOLUTIONJG714CHINESETRADITIONALANDHERBALDRUGS，2005，361116541655G714表1梯度洗脱表TAB1GRADIENTPROGRAMOFTHEMOBILEPHASETIMEG3MINAB08020157030257030278020358020表2温度G4557丹酚酸B降解速率的G5445G2721TAB2EFFECTOFTEMPERATUREONRATEOFLABHYDROLYSIS温度1/TK1G2465G5224速率常数G708H1G7091PH093RPH20R90000275400693099280043309960800002832004360996300276098007000029140023609890001860993260000300200087409970000765099845000030950004140990700039109983图1丹酚酸B的分G4388结构G708分G4388G5347C36H30O16，分G4388量718G709FIG1STRUCTUREOFLABMFC36H30O16,MW7180481216202015100500PH035PH066PH120PH20PH30PH40PH50PH60PH70LNCT/C0TIMEH图2G390C丹酚酸B在缓冲溶G9094中的一级动力学曲线FIG2PSEUDOFIRSTORDERPLOTSFORTHEHYDROLYSISOFLABINBUFFERSOLUTIONSAT90C4896144192000204060810124896144192005010015020025030035040045KOBSH1BUFFERCONCENTRATIONMMAB70565605550454035302520图3缓冲盐浓度G4557丹酚酸BG2465G5224速率的G5445G2721A磷酸盐G708BG709醋酸盐，图中数G1552为溶G9094的PHFIG3EFFECTOFBUFFERCONCENTRATIONONHYDROLYSISRATEOFLABAPHOSPHATE,ANDBACETATE,PARAMETERINFIGUREDESCRIBEDASSOLUTIONPH012345678161412100806040200LOGKPHPH图4G3丹酚酸B的PH速率曲线FIG4PHRATEPROFILEOFLAB27282930313265432PH20PH093LNKOBSTEMPERATURET1K103图5丹酚酸B降解的ARRHENIUS曲线图FIG5ARRHENIUSPLOTSOFLAB0246810121416182022LAB1592837641110TIMEMIN020406080100RELATIVEABUNDANCERELATIVEABUNDANCE图6丹酚酸B及其水解产物的HPLCFIG6HPLCOFSALVIANOLICANDITSHYDR