动物组织基因组DNA的提取概要.ppt

实验三动物组织基因组DNA的提取 王翠芳2017 3 29 动物组织基因组DNA的提取 一 实验目的 从小鼠尾巴中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的办法 理解核酸分离纯化的基本原理 二 实验原理 DNA 主要存在于细胞核的染色体中 核外也有少量DNA 如线粒体DNA mtDNA 叶绿体DNA cpDNA 质粒DNA RNA 存在于细胞质中 如mRNA rRNA tRNA等 1 核酸的分类 二 实验原理 分离纯化核酸总的原则 应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染 核酸纯化应达到的要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 其它生物大分子的污染应降到最低程度 排除其它核酸分子的污染 2 核酸制备的一般原则 二 实验原理 核酸制备时应注意的事项 尽量简化操作步骤 缩短提取过程 减少化学因素对核酸的讲解 减少物理因素的核酸的讲解 机械剪切力和高温 防止核酸的生物讲解 2 核酸制备的一般原则 二 实验原理 降低温度 改变pH值 及盐的浓度 都利于对核酸酶活性的抑制 但均不如用核酸酶抑制剂更有利 几个条件并用更好 DNA 抑制Dnase活力很容易 但防止机械拉力张力更重要 RNA 因分子较小 不易被机械张力拉断 但抑制Rnase活力较难 故在RNA提取中设法抑制Rnase更重要 3 核酸酶的抑制和抑制剂 二 实验原理 Dnase抑制 加入少量金属离子螯合剂 如0 01mol LEDTA或柠檬酸钠 Dnase基本可以全部失活 去垢剂 蛋白变性剂及Dnase抑制剂也可使Dnase失活 3 核酸酶的抑制和抑制剂 二 实验原理 RNase抑制 操作要带手套 所有器皿要严格消毒 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的Rnase抑制剂 3 核酸酶的抑制和抑制剂 二 实验原理 4 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷 结合带正电荷的蛋白质 用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂 去垢剂的作用 溶解膜蛋白及脂肪 使细胞膜破裂 溶解核糖体上面的蛋白 使其解聚 将核酸释放出来 对Rnase和Dnase有一定的抑制作用 如 SDS 脱氧胆酸钠 4 氨基水杨酸钠 萘 1 5 二磺酸钠等 二 实验原理 5 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用 使蛋白质变性 沉淀 从核酸提取液中分离除去 以防造成蛋白质污染 使蛋白质变性 故可使核糖体解聚释放出核酸 某些蛋白质变性剂也可抑制Rnase活性和破裂细胞的作用 如 苯酚 氯仿 盐酸胍 DEPC 二 实验原理 6 核酸制备的步骤 破碎细胞 提取 纯化 二 实验原理 6 核酸制备的步骤 破碎细胞 微生物 溶酶菌 SDS裂解 高等植物 捣碎器破碎 液氮研磨 酶法 蛋白酶 胰蛋白酶 冰冻法 反复冻融或液氮冻后组织捣碎 动物 液氮处理后用匀浆器破碎 以上处理时均要加入核酸酶抑制剂 二 实验原理 6 核酸制备的步骤 首先使脱氧核糖核蛋白 核糖体 病毒的核蛋白与其它成分分离 使核酸与蛋白质分离 除去脂类 多糖的除去 破碎细胞 提取 二 实验原理 6 核酸制备的步骤 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染 并除去其它提取过程中的一系列试剂 盐 有机溶剂等 杂质 最后得到均一的核酸样品 破碎细胞 提取 纯化 二 实验原理 7 核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质温度 4 最佳最简单 70 长期保存的良好温度 20 保存介质 TE缓冲液 最常用 10mmol LTris HClpH8 01mmol LEDTApH8 0 三 实验试剂 仪器和耗材 材料 小鼠尾巴 仪器 离心机 各种规格移液器 无菌移液器吸头 分光光度计 试剂 组织基因组DNA提取试剂盒无水乙醇 四 实验步骤 在液氮中将组织块研磨粉碎 取不多于50mg磨碎的组织 放入1 5或2 0ml离心管中 注意 样本的磨碎程度将影响裂解效果 加入600ul的FLBuffer和10ulPKsolution 混合均匀 注意混合充分将有助于裂解 于56 温浴15min 如果组织较难裂解完全 可以适当延长温浴时间 甚至过夜 然后14000g离心3min 取500ul上清液 至新的2 0ml离心管中 四 实验步骤 加入700ulbindingbuffer和300ul无水乙醇 颠倒混匀 将混合液转移至SpinColomn 于10000g离心1min 并弃去接液管中的液体 由于混合液体积大于750ul 请分两次离心过柱 向Spincolomn中加入500ul的PWBuffer 于10000g离心30s 并弃去接液管中液体 向Spincolomn中加入600ul的WashBufer 于10000g离心30s 并弃去接液管中液体 重复实验步骤9 四 实验步骤 11再次将SpinColomn于10000g离心1min 并将SpinColomn转移至一个新的1 5ml离心管 12向Spincolomn中加入100ul 200ulElutionBuffer 并于室温放置1min 1310000g离心1min 并弃去SpinColomn 1 5ml离心管中液体含有DNA 五 实验结果 检测DNA的浓度和质量 取出一部分的DNA 用elutionbuffer稀释到一定的倍数 用