微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量实验报告.docx

微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量摘要：本实验采用微波辅助萃取法快速萃取梨、柠檬和橙中的维生素C，采用高效液相色谱进行分析，以维C标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中维C的峰面积，由校准曲线计算其浓度。测得梨、柠檬和橙中的维生素C的含量分别为0.8555mg/100g、44.58mg/100g、51.19mg/100g。具有准确度高，操作简单，定量准确迅速的优点。关键词： 微波辅助 高效液相色谱 维生素C 1. 引言 维生素C ,又称为抗坏血酸,是一种人体必需的水溶性维生素,也是一种天然抗氧化剂,是维持机体正常生理功能的重要维生素之一,具有多种重要的生理功能,广泛参与机体氧化、还原等复杂代谢过程。维生素C 是维持人体健康的一种重要物质,在人体内不能合成,主要从膳食中获取1 。具有保持肌肤润滑、防止衰老、抗坏血酸等作用，是人体必需的主要维生素之一。维C 在水果中主要以还原型(ASA) 存在。能溶于水、乙醇和甲醇，而不溶于其他有机溶剂，具有酸味和还原性，有4 种异构体，即L-抗坏血酸，D-抗坏血酸，L-异抗坏血酸，D-异抗坏血酸。天然抗坏血酸主要以L-抗坏血酸为主，其效力最高，也是通常所指的抗坏血酸。2分析维生素C 的方法大致有以下几类:2 ,6-二氯靛酚滴定法,该法对无色或浅色果蔬样品的测定容易把握,但对深色果蔬样品及产品的滴定终点较难掌握,往往影响测定结果；梯度比色法,对低维生素C 含量和较熟悉样品的测定较为适宜,但对试样本身带有色素的样品测定则有一定的系统误差；荧光分析法,具有高灵敏度、高选择性,主要应用于临床代谢研究和病理检测；电位测定法,对植物样品维生素C 的测定比较适合,但是其选择缓冲体系很重要；分光光度法,在一定的Vc 浓度范围内,具有良好的线性关系。在近几年的Vc 研究中使用较多的方法是高效液相色谱法。3 本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的Vc，采用高效液相色谱进行分析，以Vc标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中Vc的峰面积，由校准曲线计算其浓度。4该方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度,而且简便快速,更加适用于维生素C 的测定。2.实验部分2.1仪器与试剂仪器：高效液相色谱仪：LC-20A(岛津香港有限公司)；微波萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；色谱柱：依利特或Phenomenex C18柱 (250 mm4.6 mm，I.D.5 m)；平头进样器。试剂：乙腈(色谱纯)，冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；青椒、番石榴或西红柿等蔬果样品。实验用水为超纯水。Vc标准溶液：快速准确称取0.025 g Vc，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得到100 mg/L标准溶液备用，现用现配。色谱条件：流动相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液(v/v)；流速1 mL/min；柱温30，紫外检测波长265 nm；进样量10 L。2.2实验步骤(1)按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。(2)样品准备： 准确称取切碎的蔬果样品5.0 g，以1 mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为600 W，萃取时间为10 min，萃取温度设定为50，平行萃取两次。萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。(3)定性分析：分别取10 L 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。(4)校准曲线绘制：分别配制5，20，50，80，100 mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定3次。以Vc色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。(5)定量分析：供试品溶液经0.45 m微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。平行测定2次，记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100g表示。(6)实验结束后，按要求清理好仪器。2.3注意事项(1)不同蔬果中Vc含量有较大差异，应注意保证样品溶液浓度在校准曲线范围内；(2)校准曲线绘制和实际样品测定条件应严格一致；(3)应在老师指导下使用微波萃取仪和液相色谱仪。3实验结果与讨论3.1实验原始数据记录表1.维C标准样品液相色谱数据CVc/mgL-1保留时间t/min峰面积A51.814175241201.812718807501.8101750647801.80927642011001.8033392501表2.样品的相关数据样品保留时间t/min峰面积A质量m/g梨1.837455145.0169柠檬1.8097866474.9999橙1.8089272265.16313.2维C及样品溶液的标准曲线3.2.1维C的标准曲线由表1中的数据，以Vc色谱峰面积对浓度作图，在Origin软件中绘制校准曲线，如图1所示。图1.维C峰面积-浓度标准曲线由Origin软件得到，峰面积A和浓度C的拟合直线截距为30962，斜率为33908，故拟合曲线方程为：A/mAUs33908C/mgL1 30962 R0.9998拟合曲线的相关系数R0.9998，说明直线的拟合效果好，标准溶液的配制较为准确，绘制的标准直线较为精确。将浓度为5mg/L标准样品在色谱中测得的数据，在Origin软件中拟合得到的曲线如图2所示：图2. 浓度5mg/L标准样品的色谱图根据标准样品色谱图上维C峰对应的停留时间，就可以判断样品色谱图中维C峰对应的位置。再将样品色谱图中对应位置的色谱峰进行积分，得到峰面积，通过峰面积在已得到的维C标准曲线上，就可以定量地计算出样品溶液中维C的含量，达到对样品溶液定性和定量分析的目的。3.2.2样品的标准曲线将样品梨、柠檬、橙溶液在液相色谱测得的数据，在Origin软件中拟合得到的曲线如图3图6所示：图3.样品梨的色谱图观察梨的色谱图，发现梨的色谱图中基线起伏较多，在维C吸收峰的周围有较多杂峰，这给峰面积的积分带来了一些干扰。也说明了梨的样品溶液中含有较多的干扰杂质，但梨的维C吸收峰t=1.837 min还是较为明显。从下文的计算中可以得出，梨的维C含量要远远低于其它两个样品柠檬和橙的含量，我个人认为这也是造成梨的色谱图基线不平坦，杂峰较多的原因之一。图4.样品柠檬的色谱图观察柠檬的色谱图，可以明显看出柠檬的色谱图基线相对于梨的色谱图来讲，比较平坦，杂峰较少。在距离维C色谱峰较远的地方，基线都十分平坦，只有在维C谱峰附近才有少量杂峰，维C峰t=1.809 min十分明显，峰面积积分较为简便。从上述分析可以得到：柠檬样品溶液中含有的干扰物质较少，维C含量也较高。图5.样品橙的色谱图相对来讲，橙的色谱图是三个样品中最好的，杂峰少，基线平坦，维C峰t=1.808 min附近杂峰也较少，积分简便。可以看出，样品橙溶液中含有的干扰杂质相对来讲是最少的，从计算结果看，其维C含量也是最高的。综合观察标准样品、样品梨、柠檬和橙的色谱图，可以发现在维C色谱峰的右侧，停留时间t2 min的地方每个色谱图都有一个较为明显杂峰，只是在不同的色谱图中相对的峰高不同。标准样品、样品梨、柠檬和橙的乙酸溶液中，相同的成分除了维C之外，应该就只有乙酸和水了，我个人推测这是乙酸的色谱峰，但具体结论需要进一步实验验证才可以得出。另外，观察到维C谱峰的保留时间都在t=1.810 min附近，保留时间较短，这与色谱柱的性能有关。性能好的色谱柱保留时间应该更长，由于实验中使用的色谱柱工作时间较长，老化严重，所以保留时间比较短。3.3样品维C含量的测定已知样品梨、柠檬、橙中维C对应的色谱图峰面积分别为45514、786647、927226，样品的质量分别为5.0169g、4.9999g、5.1631g。将其分别代入标准直线方程中，计算的结果如下：(1)梨： 浓度C(4551430962)/33908 mgL-10.4292 mgL-1100 mL样品梨乙酸溶液中含有维C的质量为：m=0.4292 mgL-110010-3L=4.29210-2 mg5.0169 g梨中含有维C的质量为4.29210-2 mg，所以梨中维C的含量为：CVc = 4.29210-2 mg /5.0169 g 100 g = 0.8555 mg/100g(2)柠檬：浓度C(78664730962)/33908 mgL-122.29 mgL-150mL样品柠檬乙酸溶液中含有维C的质量为：m=22.29 mgL-110010-3 L =2.229 mg4.9999g柠檬中含有维C的质量为1.114 mg，所以柠檬中维C的含量为：CVc =2.229 mg /4.9999 g 100 g = 44.58 mg/100 g(3)橙：浓度C(92722630962)/33908 mgL-126.43 mgL-150mL样品橙乙酸溶液中含有维C的质量为：m=26.43 mgL-1100 10-3 L =2.643 mg5.1631 g橙中含有维C的质量为1.322 mg，所以橙中维C的含量为：CVc = 2.643mg /5.1631 g 100g = 51.19 mg/100g结果汇总如表3所示：表3.样品维C浓度及含量样品梨柠檬橙浓度/mgL-10.429222.2926.43含量/(mg/100g)0.855544.5851.194分析讨论4.1校准曲线法的优缺点校准曲线法是用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。校准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。但这只是对待测体系较为简单，体系中其他物质对待测物质没有影响或影响较小的情况下适用。比如本实验就利用校准曲线法测定不同水果中维C的含量，水果的乙酸萃取液相对来讲，成分比较简单，干扰因素比较少，所以适用于用标准曲线法来测定其维C含量。校准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。另外，对于待测体系成分复杂，很难在绘制标准曲线时，保证标准液的体系环境与待测液相同时，就不能用校准曲线法进行含量测定。否则，就会造成较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。4.2液相色谱法中常用的定性定量方法液相色谱法中有很多定性定量的方法，下面列举其中几种比较常见的方法。定性方法：(1)根据保留时间定性基本依据是：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该具有相同的保留时间。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件下，具有相同保留值的两个物质却不一定是同一物质。因此使用保留值定性时必须十分慎重。利用已知标准物质直接对照定性是一种最简单的定性方法。要求必须在具有已知标准物的情况下，方能使用本法。本实验就是根据保留时间定性的，先测定标准样品维C的保留时间，再在相同的色谱测定条件下测定样品，在得到的样品色谱图中，找到相应的保留时间即可定性的判断维C的存在。(2)利用不同色谱检测方法定性 同一样品可以采用多种检测方法检测，如果待测组分和标准物在不同的检测器上有相同的响应行为，则可初步判断两者是同一种物质。在液相色谱中，还可通过二极管阵列检测器比较两个峰的紫外或可见光谱图。(3)保留指数定性在气相色谱中，可以利用文献中的保留指数数据定性。保留指数随温度的变化率还可用来判断化合物的类型，因为不同类型化合物的保留指数随温度的变化率不同。(4)柱前或柱后化学反应定性 在色谱柱后装T型分流器，将分离后的组分导入官能团试剂反应管，利用官能团的特征反应定性。也可在进样前将被分离化合物与某些特殊反应试剂反应生成新的衍生物，于是，该化合物在色谱图上的出峰位置或峰的大小就会发生变化甚至不被检测。由此得到被测化合物的结构信息。(5)与其他仪器联用定性 将具有定性能力的分析仪器如质谱(MS)、红外(IR)、原子吸收光谱(AAS)、原子发射光谱(AES，ICP-AES)等仪器作为色谱仪的检测器即可获得比较准确的定性信息。定量方法：(1)归一化法 所谓归一化法就是以样品中被测组分经校正过的峰面积(或峰高)占样品中各组分经校正过的峰面积(或峰高)的总和的比例来表示样品中各组分含量的定量方法。当试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号时，可用归一化法计算组分含量。归一化法定量的优点是简便、精确，进样量的多少与测定结果无关，操作条件(如流速、柱温)的变化对定量结果的影响较小。如果试样中的组分不能全部出峰，则绝对不能采用归一化法定量。(2) 标准曲线法 (外标法)标准曲线法也称外标法或直接比较法，是一种简便、快速的定量方法。与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测组分的标准样品绘制标准曲线。具体方法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。(3) 内标法内标法是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。若试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或某几个组分的含量时，可以采用内标法定量。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物（参见内标物条）加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子，即可求出被测组分在样品中的百分含量。4.3如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？(1)首先根据未知物的性质，选择合适的液相分离机制，例如液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法、离子交换色谱法等等。(2)选择合适的流动相，需要考虑待测物在两相间的吸附及脱附能力，选择合适的流动相已达到最好的分离效果。(3)选择合适的色谱柱：色谱柱是液相色谱分析的核心组件，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等，选择合适的色谱柱对液相色谱分析至关重要。根据分析对象的极性、吸附能力等选择合适的色谱柱，如正相色谱柱、反相色谱柱、离子交换色谱柱等。(4)设置其它色谱分析的参数。例如压力泵的压力、流动相的流速、柱温箱的温度、采集样品的数量等等。4.4微波辅助萃取法能达到快速高效的萃取效果的原因物质吸收微波的能力，主要由其介质损耗因数来决定。介质损耗因数大的物质对微波的吸收能力就强，相反，介质损耗因数小的物质吸收微波的能力也弱。由于各物质的损耗因数存在差异，微波加热就表现出选择性加热的特点。采用微波加热就能够有选择地加热吸收微波能力强的物质，从而使得被萃取的物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中，达到分离萃取的目的。另外，微波加热还具有迅速、均匀的特点。微波能够透射到生物组织内部，以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，增加分子的运动，导致热量的产生。所以，微波加热是整体加热，被加热物每个区域都同时加热，而不是传统的热量由外到里传递。4.5比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点液相色谱法和气相色谱法有各自的优缺点，也有各自适合的应用范围。(1)气相色谱采用气体作为流动相，由于物质在气相中的流速比在液相中快很多，气体又比液体的渗透性强，因而相比与液相色谱，气相色谱柱的阻力小，可以采用长柱，例如毛细管柱，分离效率较高。(2)由于气相色谱不需要使用有机溶剂和价格昂贵的高