药物吸收体外研究方法的概述.doc

药物吸收体外研究方法的概述综述药物吸收体外研究方法的概述周昕上海中医药大学附属龙华医院药荆科,200032上海摘要本文对各种药物吸收的体外试验方法进行了概述,并比较分析了各种方法的优缺点,以便于研究人员对药物吸收研究方法有一个大致的了解,并在运用时根据药物的特性,实际要求及具体情况选择合适的模型.关键词药物吸收;离体外翻囊;Ussingchambers;细胞模型中图分类号:R965.2文献标识码:A文章编号:1009.2501(2006)04037906对于每一种进入市场的新药,制药公司必须筛选将近5000种化合物,这些化合物大多来源于天然或通过化学合成.组合化学和自动控制技术的日益成熟使一天合成成千上万化合物成为可能,克隆技术和细胞分析等手段也使人们可以快速地评价这些化合物的生物学特性,高通量筛选技术有时可以使药学研究人员1天内测试10万种化合物的生物学活性,但是这些化合物中有将近40%不能进入市场,主要的原因是不良的生物利用度u.而众所周知,最常用的给药途径是口服吸收,为了达到靶器官,必须有足够量的药物分子从胃肠道吸收进入血液循环.影响药物吸收的原因很多【2,例如:(1)化合物的理化特性:立体化学结构(包括手性),进入细胞膜的比例,分子量,分子体积,pKa,溶解度,渗透性,亲水亲脂性,化合物稳定性,分配系数,剂型因素等等.(2)胃肠道环境和解剖生理状态:胃肠道的运动,肠pH值,血流量,胆汁的影响,淋巴液流量,粘20051219收稿2006-.04-07修回周昕,女,博士,主管药师,研究方向:药物体内过程.Tel-mail:?379?中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办CN34-1206/R,ISSN1009-2501E-mail:cepO621cn.c0rn20O6Apr;11(4):379384膜溶解度,小肠上皮细胞中各种特异性转运系统和多药耐药性(multidrugresistanceMDR),p-糖蛋白(Pglycoprotein)等等.(3)其他因素:病理状态,基因差异,个体差异,种族差异,药物相互作用,药物与饮食,营养的相互作用等.药物吸收机制也不是单一的.研究表明_3药物分子进入肠上皮细胞存在着5种机制:被动的跨细胞转运体(吸收)(llularpassivediffusion),被动的跨细胞旁路转运体(吸收)(paracellular),载体调节的跨顶膜(肠腔侧)转运体(吸收)(carrier-mediateduptakeattheapicaldomainfoUowedbypassivediffusionacrossthebasolateralmembrane),载体调节的跨顶膜(肠腔侧)和基侧膜(血液侧)转运体(吸收)(carrier-mediateduptakeattheapicaldomainfoUowedbypassivediffusionaCrOSStheapicalandbasolateralmembrane)以及载体一调节跨顶膜的外流转运体(分泌)(transcyto-sis).在以上5种机制中,唯一影响药物吸收的是载体依赖性跨顶膜的外流转运机制.目前研究已发现的药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)和多药物抗性基因(MDR一1)的蛋白产物P.糖蛋白(PgP)主要作用于载体调节跨顶膜的外流转运体上,限制药物吸收后的生物利用度J.因此,抑制小肠上的P一印活性,将有助于药物的吸收和代谢.人们采用了许多方法,包括体内试验法,体外试验法,在体试验法等方法b来评价药物,预测影响胃肠道吸收和代谢的机制及因素.由于对体内和在体研究已有系统的论述L6j,这篇综述重点讨论不同的体外研究方法,并对它们的优缺点进行了比较.1离体组织1.1离体肠段本法是将动物肠道的一部分摘除,在脱离肌体其他组织的状态下进行的一种实验.该法的优点在于:灌流的小肠段可以用于研究药物?380?吸收和代谢的各个阶段,不受一些生理因素例如胃肠道的排空,小肠表面积等因素的影响,相比整体动物而言有一定优势.缺点在于:(1)离体状态下进行的实验完全停止血供,故与实际生理条件不同,导致用这种方法所得到的药物吸收速度通常要比实际吸收速度J慢得多;实验中组织的变化过于迅速,水分的摄取使肠管内的药物分布容量发生变化,从而引起表观吸收的变化;本法实验中,脂溶性小的离子型药物可能比脂溶性大的分子型反而透过快,这是由于血液停止使离子型较分子型更有利于扩散透过等.在具体分析实验结果时,应慎重;(2)要考虑到对于不同肠段,药物通透性是不同的,一般而言,按照空肠>回肠>结肠的顺序,药物的通透性递减;(3)实验所需化合物量大;(4)从一只动物中取得的肠段是有限的;(5)因为是离体制备,灌流小肠段的存活率也是有限的.总言之,本方法简单,对研究药物跨膜吸收,被动吸收和主动转运过程的机制有一定价值;并可单独用于研究影响吸收的因素.该技术仅限于从粘膜层取样,并假设药物的消除量等于药物的吸收量.该法不适合用于新药筛选.1.2离体肠外翻囊技术I.离体肠段很难长时间存活,因为组织需要充氧,为了解决这个问题,科学家们翻转小肠接扎成囊,囊内外都充满了氧饱和的缓冲液,从而解决了这个问题.本法优点在于:方法简单;所有细胞类型和粘膜层均存在;从分析的角度来看,囊内即浆膜层的液体体积较小,药物积累得较快,所用的药物较少;粘膜层暴露于较大体积的充氧缓冲液,有助于囊存活.主要缺点是:离体的肠组织血流完全停止,在分析实验结果时应慎重;在囊翻转后5min,细胞的形态学开始改变,0.5h后.50%75%的上皮细胞开始扭曲,1h后,整个上皮细胞刷状缘毁坏.因此实验时必须注意组织的功能或形态不要发生改变.离体肠外翻囊技术是一种可靠的测定药动学参数的方法.过去用于测定大分子和脂质体的转运,但近来常用于定量测定亲水分子在不同位点细胞旁路的转运和吸收,估计增强剂对他们吸收的影响;也用于测定小肠不同位点的吸收值和进行结肠的预实验;便于研究PgP对药物穿过肠屏障的影响等.由于组织的功能或形态易发生改变,该法只适于研究快速转运.1.3Ussingchamber上世纪五十年代早期,Ussing和Zehran首次用UssingChamber研究蛙离体皮肤ChinJClinPharmacolTher2006Apr;ll(4的Na电流主动转运.将除去肌肉组织的动物的一段肠固定在Ussing型灌流槽中,这槽分上下两腔.上皮单层的顶膜浸在上腔的溶液中,基侧膜浸在下腔溶液中,两腔互不相通.肠上皮单层两侧灌流液缓冲液,电压钳条件下,一根电极置于下腔作为引导电极,另一根电极置于上腔作为参考电极,从置于下腔的引导惦记记录跨上皮电压(Vte).为了测量跨上皮电阻(Rte),将一根通电电极置于于下槽,向上皮单层通一恒定的电流(50100),记录Vte的变化.根据Ohm定律计算Rte和等效短路电流Ie.在测得稳定的Vte后,以证明上皮功能的完整性和活性,是否能允许离子流透过膜.然后在上腔中加入各种药物,然后在不同的时间段从下腔抽取固定量的溶液,通过HPLC方法测定从上腔进入下腔的药物量.通过药物的有效通透系数来评价药物吸收的动力学变化.Ussingchamber的好处在于:能测定转运电流,从而可以说明是否有载体或外流泵参与转运;能对转运的不同阶段进行研究;也可应用于研究药物的肠代谢;如果配以电极,Ussingchamber还可用于研究药物对肠电生理参数的影响等.缺点在于:该法比较复杂,所需药物的量也比较多,人和动物载体的表达有差异,实验数据可能与实际有偏差.2离体细胞用外力,酶或试剂使小肠细胞从粘膜层上消化下来,离体细胞用于研究小肠药物的吸收.消化细胞的过程会损伤细胞,最终会影响细胞的活力;细胞必须制成混悬液,不具备小肠粘膜细胞的极性;因此,小肠离体细胞常用于研究药物摄取,不能用于药物的转运研究.3膜囊泡将膜囊泡混悬在含药缓冲液中,摄取药物,从而模拟药物吸收的过程,用于研究药物的吸收或代谢,包括刷状缘膜囊泡和基底膜囊泡.制备刷状缘膜囊泡最常用的方法是用钙或镁离子沉淀.加入二价离子后,由于细胞被膜的多糖一蛋白质复合物的二价离子与钙镁等离子结合,使基底膜聚集在细胞间,而刷状缘膜不结合;低速离心,除去基底膜和细胞间杂质等沉淀,上清液中含有刷状缘膜;高速离心,得到刷状缘膜沉淀.如需进一步精制,再重复二价离子沉淀过程.制备基底膜囊泡的过程是:细胞匀浆后,低速离国临床药理学与渔堂;(心除去整个细胞和杂质,再高速离心,得到沉淀,沉淀中有绒毛层(含有基底膜),混匀后,梯度离心,测试每个组分,例如基底膜的标记为Na?K?ATP酶,刷状缘的标记物为碱性磷酸酶等.将含有基底膜的部分稀释后,高速离心,混悬在适宜的缓冲液中,用于研究.本方法的优点在于:实验时间比较短;所需的药物比较少;囊泡制备比较方便;可以用于研究药物的特性,营养物质的转运;分离了刷状缘膜和基底膜,以区分小肠细胞的顶膜和基底膜的转运;可以用于研究囊泡内和囊泡外的溶解环境;膜囊泡还是研究葡萄糖和与Na相关的转运的主要工具;从正常组织和病理组织上分离得到的囊泡可以用于研究疾病状态对特定转运的影响;囊泡也可以用来研究一种物质对小肠酶和脂类成分的影响等.但是应用本法时应该注意:囊泡不是很纯,可能含有其他碎片;在制备囊泡的过程中,因为使用了消化液,可能对蛋白质造成损伤;制备囊泡的重现性并不好;缺少细胞代谢,因此不能用于研究ATP依赖性转运,以及细胞旁路转运.4细胞培养模型虽然膜囊泡比离体组织更能清楚地阐明药物吸收机理,但是它们不能说明药物在细胞内的情况.为了更好地理解药物通过小肠细胞的转运,需要建立一个模仿小肠的极性系统,因此单层的,稳定的细胞模型就被用来研究肠细胞对药物的转运,代谢和分化.目前常用的细胞模型有CaCO.2,TC7,MDCK等细胞模型.4.1CaCo-2细胞CaCo.2细胞(thehumancolonadenocarcinomacelllines)模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药物吸收的体外模型,在吸收过程研究中,比较简单,重复性好,应用范围较广.CaCo.2的来源和特性:CaCO一2细胞系来源于人的直肠癌,其结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞,含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系.与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化(反分化)不同,CaCo.2细胞在传统的细胞培养条件下,生长在多孔的可渗透的聚酯(Polycarbonate)膜上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞,形成连续单层u.培育约10d后,单层的跨膜电阻(transepithe.1ialelectricalresistance,TEER)约为260Ohms?cm,细胞密度约为0.91cm,此时CaCo.2细胞单层对漏出标志物如聚乙二醇(Mt000)或甘露醇是不渗.tt.,r,一_,.?381?透的,这种性质可以维持恒定约20d,由于CaCo?2细胞性质类似于小肠上皮细胞,因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验n.用电子显微镜进行的亚显微结构研究表明,CaCo.2细胞与人小肠上皮细胞在形态上十分相似,具有相同的细胞极性和紧密连接;存在于小肠上皮中的各种转运系统,代谢酶等在CaCo.2细胞中都有相同的存在,如谷氨酰胺转肽,碱性磷酸酶,蔗糖酶,葡萄糖醛酸酶,P450细胞色素同工酶及糖,氨基酸,二肽,维生素B12等多种主动转运系统在CaCo.2细胞中都有与小肠上皮细胞类似的表达,因此CaCo.2细胞模型的跨膜转运实验可以作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型.CaCo一2细胞模型的药物转运机理:在CaCo.2细胞模型中,药物的转运过程为:药物分子从CaC2单细胞层的顶侧.肠腔侧(AP侧)跨过CaCo.2单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧(BL侧).吸收好的药物通常脂溶性较大,易分布于肠上皮细胞膜,由于刷状缘细胞面积巨大,此类药物基本上是经被动跨膜转运途径的;吸收缓慢且较差的药物如亲水性药物以及多肽等,不易分布至刷状缘,而是由旁路细胞转运透过上皮,但由于刷状缘细胞面积远大于(100倍)细胞侧面连接间的面积,这足以补偿两种转运间的差别,所以亲水性药物跨膜转运与胞旁转运几乎相当,对于亲水性药物的胞旁转运通路,有实验证明紧密连接是限速因素n.有些药物由于与营养物质结构相似可经主动转运吸收.CaCo.2细胞模型有3条主动转运;二肽载体,P.糖蛋白,寡肽载体,其中多数是半载体介导.半被动转运吸收,若被动转运的渗透系数小,则载体饱和将使吸收分数下降,而对于P.糖蛋白介导的药物外排,其过程的饱和则可使吸收分数增加;胞饮作用由于容量小而极少被考虑.它主要用于大分子药物转运.CaCo一2细胞模型与小肠中药物转运的关系:对于吸收良好的药物(被动转运),CaCo-2细胞模型是一个研究药物吸收的极好模型;对于吸收差的药物,CaCo一2细胞模型只能作为体内吸收的一个定性而非定量指标.其原因有两方面:一方面是caCo.2细胞模型中紧密连接的渗透系数比正常小肠小;另一解释是吸收面的差异,吸收差的药物在体内扩散距离加长,它虽不会使吸收面增加,但药物会通过基底部胞旁通路的缝隙被吸收进入体内,从而提高吸收分数.对于载体介导的药物转运而言,只有caco.2细胞上的相关载体充分表达后,药物在CaCo-2细胞模?382?型中转运才能与体内转运状况相关,而且相关强度会因化合物不同而异.这也表明CaCo一2细胞模型是被动转运较好的体外模型,对其他转运途径只可作为参考模型.CaCo-2细胞模型在研究药物吸收方面的应用:由于CaCo-2细胞的上述特性,CaCo.2常用于开发新药时的研究u引.口服药物吸收特性的研究.包括研究口服药物从AP到BL和从BL到AP的转运;了解小肠吸收El服药物的结构特性,促进有效口服药物的发现;筛选在肠液中稳定,小肠表皮运转良好的候选药物;对代谢困难,生物利用度低的口服药物进行结构修饰,以提高肠吸收的生物利用度;研究前药的代谢和转运,筛选先导化合物等.研究口服药物的吸收转运机制.例如:Artursso.n1胡报道了经细胞和细胞旁路被动扩散的药物在人体的口服吸收和透过CaCo2细胞单层的转运速率(apparentpermeabilitycoeflqcientsPapp);CaCo.2细胞模型还常被用来研究P.glycoprotein对药物吸收的影响等.复合组分中有效成分的研究.天然药物提取物中含有许多成分,通过其在CaCo一2细胞单层中的转运研究,可探知有效成分.例如:在美国用于治疗抑郁症的金丝桃提取物,普遍认为有效成分是金丝桃素,通过CaCo-2细胞转运实验,发现原金丝桃素也是有效成分之一.研究药物的化学结构与吸收转运的关系,指导药物结构的优化.可以利用CaCo.2模型估计药物化学结构对吸收转运的影响,以便于对药物的化学结构进行改造.例如:有报道l引1,5.苯二氮卓类化合物,其化学结构和吸收转运间有较强相关性;Hovssa等研究了0.cyclopmpranecarboxylicacidester前药的转运,发现增加亲脂性可使前药的通透性较母药提高12倍等.研究辅料以及剂型对吸收的影响.可以利用CaCo-2模型对剂型处方,辅料进行改进.例如:Di.mitrijevic考察了几种非离子型表面活性剂对模型药物二甲双胍转运以及对于CaCo.2细胞单层完整性的影响;HovggardLEq等研究了一些环糊精对吸收的促进作用,发现二甲环糊精能使PEG40的吸收提高10倍,而所用浓度对细胞毒性很小;Ginski=3利用CaCo-2模型发现在速溶处方中的吡罗昔康是渗透限速型吸收,而在较慢溶出处方中吡罗昔康是溶出限速型.ChinJClinPharmacolTher2006Apr;11(4CaCo.2细胞模型的评价:CaCo.2细胞模型作为药物吸收研究的一种高通量筛选(highthroughoutscning)的工具,能够在细胞水平提供药物分子通过小肠黏膜的摄取引,代谢,排放,跨细胞转运的信息,对于进入黏膜细胞的药物的吸收,比以往的离体实验技术,在体吸收实验方法更适合;同时它提供了药物可能引起的粘膜毒性的信息,也提供了药物结构转运方面的信息;CaCo.2细胞来源是人结肠癌细胞,同源性好,其结果具有良好的重现性;培养成熟的CaCo-2细胞如同正常的小肠上皮细胞一样是致密的单细胞层,其外表面AP和基底侧面BL有着不同的分化形态和功能,用CaCo.2模型可以分别研究之,动物实验则不能;CaCo.2细胞内有药物代谢酶,可在有代谢的状况下测定药物的跨膜转运;可测定药物的细胞摄取及跨膜转运;可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别;与实验动物相比,培养细胞比培养动物更经济省时等.然而,CaCo.2细胞也有一定缺点:缺少部分代谢酶,例如在大部分肠细胞中普遍存在的CYP3A,在CaCo.2细胞中表达就非常少;在CaCo.2单层细胞中的Pgp活性大于人体内活性;分化的CaCo-2细胞单层中精密连接比在小肠上皮细胞中更具有特征性,其TEER值要比正常小肠上皮细胞高;CaCo.2细胞单层缺乏粘蛋白产生细胞,因此缺少肠壁的粘膜层,而粘膜层是吸收的主要屏障之一;缺少细胞异质性(单一细胞构成);细胞有肿瘤起源;此模型不能说明生理参数如小肠流动性或运送时间在药物分子吸收中的作用;细胞培养的时间和代系对于CaCo.2细胞的形态学和生理学性质有影响,从而影响细胞对药物的转运;不同实验室之间由于培养条件的差别,使结果有时缺乏可比性等等.4.2TC7细胞rI7细胞是CaCo.2细胞经甲氨喋呤处理后分离得到的,CYP3A表达比CaCo.2细胞高,能主动转运牛磺胆酸,P.gP的表达比CaCo-2低,是CaCo一2细胞的良好替代.4.3MDCK细胞MDCK(胧Idin.darbycaninekidney)细胞系是由Leighton等首先建立起来,来源于小猎犬肾远曲小管,是一种单层生长的可传代的细胞系.MDCK细胞具有极性,其基底侧贴于瓶底,面向液层有微绒毛形成,并形成圆顶,进一步的形态学研究表明这些细胞与肾远曲小管很接近.细胞之间紧密连接,细胞间通道的电阻变化范围为806O0Q?em,具有对眯吡嗪敏感的Na.K交换系统,同时亦具备某些非远曲小管的特性,如碱性磷酸中国临床药理学与治疗学2006Apr;11(4酶和赖氨酸氨基肽酶含量较多;染色体为假二倍体等.MDCK的优点在于:比CaCo一2细胞的培养时间短,跨上皮电阻低,接近于小肠,有研究表明:CaCo一2细胞和MDCK细胞的渗透性有良好的相关性,亲水分子在CaCo一2细胞中的渗透性通常比MDCK细胞低,这同CaCo-2细胞电阻稍高一致.缺点在于:MDCK细胞的犬肾起源;小肠转运体的表达也不清楚;等等.关于MDCK作为小肠渗透性模型的实验数据不多,需进一步的工作来验证.表1各种体外研究方法比较表?383?5结语通常好的吸收是药物筛选的基础,在新药研发的早期阶段,对药物吸收的研究经常采用体外实验方法,这样可以定性定量地研究药物吸收的过程.不同体外实验方法各有利弊,在本文中已进行了阐述,并简单地概括成表(表1),具体选用何种方法要根据化合物的特性,实验研究的阶段以及需要解决的问题而决定.参考文献1BrennanMB.DrugdiscoveryfalteringoutfailuresearlyinthegameJj.ChemEIlgNews,2000;5:632I-Iilgl/lKM,KatoA,BochardtRT./nv/trosystemforstudy.ingintestinal击ugabsorptionJ.MedResRev,1995;15:833TsujiA,Tamai.Carrier-mediatedintestinaltransportofdrugs【Jj.PharmRes,1996;13:963774GottesmanMM,PastanI.Biochemistryofmultidrngresistaneemediatedbythem山击ugtransporterJ.AnllllRevBiochem,1993;62:3854275HidalgoIJ.Assessingtheabsorptionofnewpharmaceuticals【Jj.CurtTopMedChem,2001;1:385一加16徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学M.北京:人民卫生出版社,2OO2:70017IsmaelJ,Hidalgo.Assessingtheabsorptionofnewpharmaceu.ticalsJj.CurrTopMedChem,2001;1:385一加18BohetH,AnnaertP,MannensG,BeijsterveldtL,AneiauxK.VerbovenP.Strategiesforabsorptionscrel】gindrugdiscov.eryanddevelopmentJ.CurtTopMedChem,2001;1:367839FerrecEL,ChesneC,ArcHP,BraydenD,FabreG,Gi麟?384?P.eta1.InvitromodelsoftheintestinalbalerRJ.rn1etpal-tandRecommendationsofECVAMwordshop,2000;6496810AllenRH,RobertAC,PhilipsSB.CaCo-2cellmonolayersasaroodelfordrugtransportacrosstheintestinalmucosalJJ.HaarmRes.199O;7:902l1GanLL.DhirenRT.ApplicationsoftheCaCo-2modelinthedesignanddevdopmen!oforallyactivedrugs:elucidationofbiochemicalandphysicalbalTielp$posedbytheintestinalepitheliumJ.AdvDrugDelivRev,1997;23:7712HidalgoIJ.RaubTJ,BorchardtRT.Characterizationofthehumancoloncarcinomacellline(CaCo-2)asamodelsystemforintestinalepithelialpermeabilityJ.Gastroenterology,1989;96:73613DantzigAH,BerginL.Uptakeofthecephalosporin,cephalexin.byadipeptidetransportcarrierinthehumanintestinalcellline,CaCo-2JJ.BiochimBiophysActa,1990;1027:211714KarlssonJ,KuoSM,ZiemniakJ.Transportofceliprololacrosshumanintestinalepithehal(CaCo-2)cells:mediationof9ecl_etionbymultipletransportersincludingPglycoproteinJJ.BrJPharmacol,1993;110:1oo91615AraBP,PalmK,LuthmanK.CaCo-2monolayersinexperimentalandtheoreticalpredictionsofdrugtransport【JJ.AdvDrugDeuvRev,20o1;46:274316AraBP.KarlssonJ.Correladonbetweenoraldrugabsorptioninhumansandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(CaCo-2)cellsJ.BiocheBiophyResCommun,1991;175:88017WuXC.W1limeldLR.StewardBH.AtorvastatintransportintheCaC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