猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化 摘要：为了提高猪戊型肝炎病毒株衣壳蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达量，研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂浓度等不同条件对衣壳蛋白基因片段融合蛋白表达量的影响。结果表明，用培养基于 培养 后，采用终浓度为 /的在 、 诱导培养 ，融合蛋白表达量最大；检测结果表明融合蛋白的分子质量与预期大小一致，约为 ； blotting结果表明，融合蛋白可以与抗阳性血清发生特异性反应，并具有良好的反应原性，说明衣壳蛋白基因片段蛋白得到正确表达。 关键词：猪戊型肝炎病毒；衣壳蛋白；片段；原核表达 中图分类号：文献标识码：文章编号：0439114（11）153116-04 V ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ，； ， ， ， ； ， ， ， ） ： To improve ， ， ， ， was ， w： s ； c ； ； p 戊型肝炎病毒（ ，）过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒。等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为 的病毒样颗粒，从而证实该病毒为新型的肝炎病毒，并对人类健康具有严重的危害性。基因组为单股正链，约 ，具有个开放读码框（）。病毒基因组的端到端依次为端非编码区、端非编码区及 尾。 编码蛋白（）抗原表位数量多，结构复杂，除端 外，大多数分布在端部分，包括了 、 、 、 、 、 、 、 、 等个抗原活性区，研究还证实在 之间至少含有个不同免疫活性的抗原表位。本试验利用软件对 株的进行潜在抗原位点分析。在 端处选取片段（ ）进行了原核表达，在克隆和表达了片段的基础上对其表达条件进行了优化，以期获得最大产量的融合蛋白用于建立快速诊断方法。 材料与方法 病毒株 经检测 为阳性的株，由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病实验室保存。 菌种和载体 菌种为大肠杆菌 ，表达菌R及表达载体（）、（）由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病实验室保存。克隆载体载体购自大连宝生物工程公司。 试剂 辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体、为鹏程公司产品。、低分子蛋白质、琼脂糖购自联创公司。 蛋白er购自鹏程公司。其余试剂均为分析纯或生化试剂。 融合蛋白的诱导表达 含基因的重组质粒、和、空载体分别导入表达受体菌中，挑取单菌落于 培养至nm，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导一定时间，并以空菌、空载体和未加的培养物作为对照；菌体离心后弃上清液，沉淀重悬于 含 的细菌裂解液，振荡混匀，室温放置 ， 、 离心 。取沉淀再重复上述步骤次，上清液均留样。使用最小体积的 mol/L的尿素将沉淀溶解， 、 离心 。沉淀中若仍有透明未溶解物质，再用 mol/L的尿素溶解， 、 离心 ，弃沉淀。重悬后加入倍上样缓冲液混匀，沸水煮 ， /离心 后取上清液进行检测，鉴定目的基因的表达情况。 融合蛋白的鉴定 otting鉴定融合蛋白，即样品经 分离后，按湿转使用说明将蛋白转至硝酸纤维素膜上， ， 完成湿转。用牛血清 封闭液室温封闭 。将硝酸纤维素膜放入干净的塑料袋中，加用封闭液稀释的人抗阳性血清（ 倍稀释），封闭塑料袋，室温摇摆平台过夜。 洗膜次，每次 。加入用封闭液以 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体，室温温育 。 洗膜次，每次 ，（氨基乙基卡唑，）显色 ，用滤纸吸干膜上残余液体，拍照保存。 结果与分析 不同表达载体对表达量的影响 分别将、的重组菌接种于含氨苄西林抗性的培养基中， 摇床培养 至nm，加入终浓度为 的， 诱导培养 ， 检测结果表明中表达量较高， 中表达量较低，因此是比较适合表达的载体。 温度对重组菌生长和a表达量的影响 重组菌 接种于含氨苄西林抗性的培养基中， 培养 至nm，加入终浓度为 的，分别在、 诱导培养 。检测结果表明， 时表达量最高，30 时表达量稍低，而在2 时表达量更低。 转速对重组菌生长和表达量的影响 重组菌接种于含氨苄西林抗性的培养基中， 培养 至nm，加入终浓度为 的， 分别在 、 和 、 诱导培养 。 检测结果表明，转速对的影响很大， 、 诱导培养条件下表达量较低。 使用浓度对重组菌生长和表达量的影响 是重组菌表达目的蛋白的诱导剂，将重组菌的接种量接种于含氨苄西林抗性的培养基中， 培养 至nm，分别加入不同终浓度的（、 ）诱导表达。检测结果表明，对融合蛋白的表达量有明显影响，加前基本不表达； 在浓度小于 时表达量较小，在浓度等于 时能完全表达，在浓度大于 时也能完全表达，因此，在浓度为 时，表达最优（图）。 诱导时间对表达量的影响 重组菌 接种于含氨苄西林抗性的培养基中， 培养 至nm，加入终浓度为 的，诱导时间分别从 至 。电泳结果表明，诱导培养 时融合蛋白的表达量较高，大于 后表达量已没有明显差别。 blotting鉴定结果 在优化条件下，将含重组质粒 的大肠杆菌菌株在 培养 后，使用终浓度为 的在 诱导培养 。检测结果表明，融合后的目的蛋白为单一条带，大小约为 ，与预计的分子质量大小相符合（图）； lotting结果表明，融合蛋白可以与抗阳性血清发生特异性反应，并具有良好的反应原性。 讨论 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 目前人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因，但是由于目的基因结构的多样性及其与大肠杆菌基因的差异，不同的外源基因在表达效率上有很大的差异。表达系统的核心是表达载体。用来在大肠杆菌中表达外源基因的载体有很多种，一般来说，这些载体应满足以下要求：重组质粒拷贝数多，表达量高；适用范围广；表达产物容易纯化；在菌体内稳定性好。不同载体的特点不同，主要的差别有启动子类型、质粒拷贝数、基因本身的因素、密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要，融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。因此在本试验中，通过不同表达载体与宿主菌?培养条件适宜的组合来使目的蛋白获得最大量的表达。 从实验结果看温度对目的蛋白表达量的高低影响较小。试验选择 作为诱导温度，是因为目的基因在低温时表达稍低，在高温时又常常会使一些蛋白积累形成包涵体。诱导温度对表达量有影响，主要体现在对宿主后续生长的影响上。 异丙基硫代半乳糖苷（）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而且十分稳定，因此是实验室常用的乳糖操纵子诱导剂，能与?编码的阻遏蛋白特异性结合，使阻遏蛋白构象发生变化，从而诱导启动子驱动重组基因的转录和表达，是一种十分有效的诱导剂。等早在年的研究表明的剂量有一定范围，浓度过低影响目的蛋白的表达，浓度过高则抑制细菌的生长，在培养基中少量存在时就可进入菌体内部发挥作用，是一种非代谢的诱导物。试验采用作诱导剂，从图可以看出，对基因的表达有关键性的影响。与诱导前相比，加入后目的基因表达条带明显增加，但不同终浓度对融合蛋白的表达量影响较小。当浓度增加到 时，蛋白的表达量较大，继续增加的浓度，蛋白的表达量不增加反而略有下降，这可能是由于较高浓度的乳糖提高了细菌的生长速度，当细菌过快生长时，质粒的拷贝数降低，导致表达量下降。在本试验中诱导表达的最佳终浓度为 。 诱导时间对蛋白表达量有一定影响，诱导时间太短，菌体量少，目的蛋白量也少；诱导时间太长，则菌体老化，酶体系统活性减弱，代谢速度减慢，转录翻译迟钝，不利于目的蛋白的表达。从试验中发现， 诱导 时蛋白的表达量最大，诱导时间过短蛋白表达量稍低，诱导时间过长，表达量已经恒定，延长时间表达已没有意义，且诱导时间达 以上时，蛋白的表达量反而降低。原因可能是由于细菌生长接近饱和而老龄菌体增加所致，有研究报道如果再更换等体积新鲜培养基诱导或可获得更高的蛋白表达量。 参考文献： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， p ，（）： ， ，（）：