猪常见病PCR检测程序.doc

猪病检测手册目录猪瘟RT-PCR检测程序3猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序5高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序7猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序9猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序11猪细小病毒（PPV）PCR检测程序13猪圆环病毒型（PCV2）PCR检测程序15细菌学检测程序17 猪瘟RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500l，-20保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-GACCTGGATGCGACTGACC-3 , 19bp ，TM为61.88。 R：5-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3, 20bp，TM为59.85。扩增的目的片段为133bp。 2、 RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 3、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳 用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟病毒阳性。猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释，用1ml RNAase-free管分装，每管200l，-20保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（pH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-CAACGCCAGCAACGACAG -3 , 18bp，TM为59.58。 R：5-ACGGAACCATCAAGCACAAC-3, 20bp，TM为57.8。扩增的目的片段为468bp。2、RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 3、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳50min观察结果，在阳性对照出现468bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现468bp的条带，判定为PRRS病毒阳性。 高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 阳性对照病料为该病的活疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-TGATGGGCGACAATGTCC- 3 , 18bp，TM为55.56。 R：5- CGCAGGCAAATCCAGAGG-3, 18bp，TM为61.11。扩增的目的片段为230bp。2、 RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 1、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序：1、94，3min2、95，30sec3、52，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现230bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现230bp的条带，判定为高致病性PRRS病毒阳性。 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、 阳性对照RNA的提取材料 阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，匀浆后-20反复冻融3次，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。三、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-GCTTGTTGGACGGCAGAG-3 , 18bp，TM为59.58。R：5-AGCCACATGATTGAGCCTTC -3, 20bp，TM为57.8。扩增的目的片段为238bp。1、 RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 2、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、53，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现238bp条带、阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现238bp的条带，判定为猪流行性乙型脑炎病毒阳性。猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序一、 基因组DNA提取及PCR扩增1、 材料与试剂 DNA提取试剂盒，PCR Mix 试剂盒购自天跟公司。引物 F：5-TCGCCGTGCTCTTCAAGG-3 18bp，TM为59.58。R：5- AGGTGTCGTTGGTGGTGTG-3 19bp，TM为59.72。扩增的目的片段为324bp。2、DNA的提取 2.1样品采集 病死或扑杀猪，取血液、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿、神经系统如大脑等组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。2.2组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于DNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于DNA的提取。2.3 DNA的提取 按试剂盒说明进行。二、PCR扩增PCR反应体系及程序：ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现324bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现324bp的条带，判定为PRV阳性。猪细小病毒（PPV）PCR检测程序一、 基因组DNA提取1、材料与试剂 DNA提取试剂盒，PCR Mix 试剂盒购自天跟公司。引物：F：5-TCGCACTAGACACCATAAACAC-3 22bp，TM为 58.21。R：5-GCCTAATTGCTGTTGCTTCTG -3 21bp，TM为58.01。扩增的目的片段为471bp。2、DNA的提取 2.1样品采集 70日龄以内流产或产死胎儿的新鲜脏器（脑、肾、肝、肺、睾丸、胎盘及肠系膜淋巴结）等，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高，母猪的胎盘和阴道分泌物。2.2组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于DNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于DNA的提取。2.3 DNA的提取 按试剂盒说明进行。二、PCR扩增PCR反应体系及程序：ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现471bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现471bp的条带，判定为PPV阳性。猪圆环病毒型（PCV2）PCR检测程序二、 基因组DNA提取及PCR扩增1、材料与试剂 50 mM的NaOH溶液、1M Tris.HCl（pH8.0）、KOD FX PCR扩增试剂盒（东洋纺产品）。引物：F：5-TCAGAAATTTCCGCGGGCTG-3 20bp，TM为57.3。R：5-AGTAGATCATCCCAGGGCAG-3 20bp ，TM为55.75。扩增的目的片段为250bp。2、DNA的提取2.1样品采集 取血液、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏等组织病变与健康部交界处组织（圆环病毒检测必须包括淋巴结样品）；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。2.2样品处理组织样品处理：称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。二、PCR扩增PCR反应体系及程序：ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、53，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现250bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现200多bp的条带，判定为PCV2阳性。细菌学检测程序HPs是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD依赖性的革兰氏阴性细小杆菌。大小为1.5*（0.30.4）um，多单个、也有短排排列，新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可成短链，并可形成荚膜，在陈旧培养物上呈多形态。无鞭毛、芽胞，美蓝染色呈两极。HPs需氧或兼性厌氧，最适生长温度3537，pH7.67.8。初次分离培养时供给5%10%CO2可促进生长，本菌培养需V因子或NAD也可满足要求。实验室使用血琼脂培养基中含有X因子及V因子，但血液中的V因子通常处于被抑制状态，HPs通常不能在含有完整红细胞的血琼脂上生长，血液加热后，细胞膜上的抑制物被破坏，V因子释放，实验室分离HPs通常使用巧克力琼脂培养基。在巧克力琼脂平板上经372448小时培养，生长的菌落呈圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、灰白色半透明的菌落，在马血琼脂平板上（加了NAD）生长良好，划线接种在有葡萄球菌的血平板上24小时后呈现卫星生长，在划线周围菌落生长良好（CAMP现象），远离葡萄球菌的HPs菌落较小。由于金黄色葡萄球菌等产色素的细菌及酵母菌，在生长过程中可合成V因子，并在培养中扩散，所以