第三讲----神经干细胞(2014).ppt

神经干细胞基础与进展 neuralstemcell NSCs 神经干细胞生物学特征神经干细胞分离培养与鉴定神经干细胞应用 1989年 Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养 发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞 其后从成年鼠纹状体 海马齿状回等处分离出能在体外不断增殖 并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群 20世纪90年代后 许多实验都证实 人脑内也同样存在神经干细胞 Mckay在1997年提出神经干细胞的概念 神经干细胞是指具有分化为神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力 能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群 神经干细胞分类 根据分化潜能及产生子细胞种类不同分类1 神经管上皮细胞 胚第3周分裂能力最强 只存在胚胎时期 可以产生成神经细胞和成胶质细胞 神经细胞 神经胶质的分化与成熟 2 神经母细胞成年人体中主要存在的神经干细胞 可以产生神经前体细胞和神经元和各类神经胶质细胞 3 神经前体细胞各类神经细胞的前体细胞 定向祖细胞 根据存在部位分 神经干细胞分类 一 胚胎神经干细胞1 来源主要集中在嗅球 侧脑室室管膜区 室下区 海马 脊髓 大脑和小脑皮质等7个部位 但干细胞的数目和发育的模式在不同种属的动物中各不相同 一般认为 并不是一群干细胞散布于多处 而是在不同部位存在着不同的干细胞群 如有些干细胞依赖EGF而发育 有些是FGF依赖神经干细胞 都具有自我新和多向分化的能力 2 神经干细胞发育的时限性胚胎神经干细胞来源 胚胎12 15天 鼠 星形胶质细胞在胚胎16天可检测到少突胶质细胞主要发生在出生时 大量的胶质细胞产生于出生后1个月 神经元在胚胎胶质细胞分化之前得到充分分化 至出生时基本完成 细胞分化时空间隔 有利于神经网络的形成 二 成年脑神经干细胞 处于静止状态1 位置 缺血 三 神经嵴干细胞 为外周神经干细胞 可发育为外周神经细胞 神经内分泌细胞和Schwann氏细胞 也能分化为色素细胞 pigmentedcell 和平滑肌细胞等 1 形态无血清培养 球型 悬浮生长 含EGF bFGF等 有血清培养 贴壁分化为成熟神经细胞CNS在不同区域可能有形态的多样性和不同的生物学特征 神经干细胞生物学特征 EGF依赖神经球细胞FGF依赖神经上皮干细胞生长方式悬浮式生长贴壁生长或悬浮生长发生时间发育后期 E14 5天后 发育中期 大鼠E10 5 小鼠E8 5 依赖生长因子依赖EGF发育依赖FGF发育表达受体EGFR不表达EGFR分布脑区 在脊髓无EGF依赖神经球出现整个发育期脊髓均有FGF依赖干细胞产生细胞不产生神经嵴和PNS细胞产生PNS和神经嵴细胞分化速率慢快此外 各类限制性前体细胞还具不同的表面抗原特性 2 神经干细胞的特异性标志 神经干细胞生物学特征 2 神经干细胞的特异性标志 musashi NSE染色呈阳性神经元 GFAP染色阳性星形胶质细胞 缺乏神经系统分化的标志如 神经元特异烯醇化酶 NSE 胶质纤维酸性蛋白 GFAP 等 一种是对称分裂 形成两个相同的神经干细胞另一种是非对称分裂 主要形式 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配 使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞 另一个子细胞则保持亲代的特征 仍作为神经干细胞保留下来 分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制 3 神经干细胞生长方式 4 低免疫源性 神经干细胞是未分化的原始细胞 不表达成熟的细胞抗原 具有低免疫源性 因此在移植后相对较少发生异体排斥反应 有利于其存活 基因治疗的载体目前神经多能干细胞被用于体外基因转导实验 转导报告基因 LacZ基因 转导神经递质合成酶 酪氨酸羟化酶 的基因用于治疗帕金森疾病 转导一种代谢性酶 葡萄苷酸酶 的基因用于治疗粘多糖病等 利用神经干细胞作为基因治疗载体 弥补了病毒载体的一些不足 神经干细胞生物学特征 5 自我更新 神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式 从而保持干细胞库稳定 克隆化的神经干细胞系 在无血清条件培养下 或经癌基因转染后 可在体外传代达三年以上 但经癌基因转染的神经干细胞在移植入体内后 其基因表达在48小时后自动下调 未发现肿瘤形成的现象 神经干细胞生物学特征 6 多潜能分化神经干细胞可以向神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力 体外培养发现 分化环境中的细胞因子对神经细胞的分化起到调节作用 因此可以在一定程度上控制其分化的时间和方向 随着对跨胚胎层分化调控机制的深入认识和争论 神经干细胞的移植将更加丰富多彩 神经干细胞生物学特征 7 良好的组织融合性 脑室内移植的神经干细胞可以通过血脑屏障 迁徙至脑实质中与宿主细胞在形态和功能上形成良好的整合 神经干细胞与宿主神经组织的良好的融合性 确保了神经干细胞的长存活 并真正达到功能修复的能力 神经干细胞生物学特征 8 迁徙 migration 能力 对损伤和疾病的反应能力迁徙是神经干细胞分化的必经阶段发育中的神经干细胞只有迁移到特定的组织才能分化为特殊功能的神经元体外培养神经干细胞移植到宿主体内后 经过一定的时间生长 移植细胞不仅可以存活 一定数量的细胞还可以迁出移植区 与宿主组织建立联系 神经干细胞具有迁徙能力 这使得在脑血管病的治疗中 可以将神经干细胞移植到损伤区边缘 神经干细胞迁移模式 1 放射状迁移 以辅助细胞的放射状胶质为引导 沿突起前进 大部分以此方式 2 正切迁移 不需要帮助 直接迁移到达目的地 14 以此途径 神经干细胞迁移机制 细胞因子影响 NRG neurogulin gliagrowthfactor slit ephrin 神经干细胞分化的调控 一 内源性因素 基因 1 促进NSC分化的基因 通过促进干细胞不对称分裂促进干细胞分化 如碱性螺旋 环 螺旋基因 bHLH基因家族 在神经元分化中起关键作用 可促进细胞脱离细胞周期 并激活下游特定神经元分化的遗传基因表达 2 抑制NSC分化的基因 通过促进干细胞对称分裂 增加干细胞数量 如Notch基因 Niche是影响干细胞增殖和分化的重要因素 包括神经细胞 神经胶质细胞和细胞外基质 Gage将神经球注入成年脑组织的某脑区观察发现 注射的神经干细胞迁移部位的不同有不同的分化方向 迁移至嗅球和海马齿状回等能产生新生神经元的脑区神经干细胞可以分化为特异功能的神经元 而之外的脑区或注射到损伤的局部则分化为神经胶质细胞 微环境对神经干细胞分化起主导作用 神经干细胞分化的调控 二 外源性因素 微环境 1 神经递质神经递质作为细胞外环境的一员 不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递 还参与NSC的增殖和分化 这些神经递质包括谷氨酸 G1u 5 羟色胺 5 HT GABA 甘氨酸 G1y 乙酰胆碱 Ach 一氧化氮 NO 肾上腺素与性激素等 神经干细胞分化的调控 二 外源性因素 微环境 2 3 4 细胞因子或生长因子的影响 神经干细胞分化的调控 3 细胞生长因子对神经干细胞增殖 分化有促进作用 有发育阶段的特异性和敏感性 如鼠胚14 18天的神经干细胞对FGF 2敏感 对EGF不敏感 干细胞本身对不同信号的敏感性及对不同信号浓度的反应性不同 表现出分化的时序性 即神经干细胞向神经元分化的时序早于向神经胶质细胞的分化 1 纤维细胞生长因子 fibroblastgrowthfactor FGF 2 EGF 表皮生长因子 为促有丝分裂因子脑发育各期均有EGF的表达 促神经干细胞增殖 体内连续6天注射EGF于Brdu标记的前脑区细胞后发现 标记细胞数量增加18倍 且分离得到的NSCS克隆数量增加3 7倍 多诱导向星型胶质细胞分化 4 5 神经营养因子 neurotrophicfactor 在培养的神经元中加入BDNF 将明显促进神经元突起的生长 促进神经元存活 注意 神经干细胞对不同种类 不同浓度的因子以及多种因子联合应用作用各不相同 在神经干细胞发育分化的不同阶段 相同因子的作用也不同 神经干细胞的应用 1 内源性神经干细胞的活化 借助细胞因子等方法将体内的神经干细胞激活 分化形成神经元或神经胶质细胞 2 外源性神经干细胞移植 将神经干细胞分离 培养并分化后直接用于移植 3 基因载体 利用病毒载体携带目的基因导入神经干细胞 筛选到高效表达目的基因的克隆进行移植 体内干细胞的功能状态受下列因素影响 1 学习因子 enrichedenvironment 是观察海马神经干细胞增殖的常用模型 2 年龄 随着年龄增长 神经干细胞的增殖能力逐渐下降 但在老年哺乳动物仍然保留此功能 3 应激因素 糖皮质激素 紧张等应激因素可使中枢内神经发生明显下降 4 生长因子 对体内外神经干细胞均有影响 5 神经递质 GABA Glu等对神经干细胞增殖也有影响 6 其它 损伤 癫痫发作或诱导 锻炼等因素可促进脑内神经干细胞的分裂增殖 一 内源性神经干细胞的活化 神经干细胞的应用 1 脑损伤时神经干细胞的增殖 成年CNS中 尤其是齿状回的神经组织发生常受到环境因素的调控 如追踪眨眼训练和空间探索训练 两种依赖海马的任务均可加强成年大鼠海马中神经组织的发生 相反 心理压力和长期给予吗啡和海洛因者 可使成年动物海马齿状回的神经组织萎缩 功能受损 研究提示 内源性神经干细胞可针对环境的变化调整增殖与分化的速度 一 内源性神经干细胞的活化 2 脑损伤时神经干细胞的迁移和分化 神经干细胞的迁移能力与神经信号 细胞因子 生存微环境等多种因素密切相关 现已证实在脑损伤时 NSC具有迁移能力 且受病变部位信号的诱导向病灶区迁移 从细胞结构上与宿主细胞整合 可分化为特定的神经细胞 并与周围神经元建立突触联系 为恢复神经功能提供结构上的保证 一 内源性神经干细胞的活化 3 但内源性神经干细胞激活修复CSN存在以下问题 NSC数量不足 调节始动 聚集 迁移 分化 成活 轴突延伸和突触形成的细胞因子不足使新生的神经细胞达到应有的数量和满足功能需要 在CNS受损后 分化而成的细胞多为神经胶质细胞 其可能原因有 1 原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用 2 患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活 激活内源性神经干细胞以治疗神经系统损伤研究不成熟 移植是目前最有前途的治疗方案 一种理想的可移植细胞应具备以下三点 1 强大的增殖潜能 以便在体外培养获得大量可供移植的细胞来源 2 表现未成熟特征及表型的可塑性 3 增殖和分化的可控性 NSCS是细胞移植治疗颅脑损伤的一种良好来源 二 神经干细胞移植 神经干细胞用于治疗的可能机理1 患病部位组织损伤后释放各种趋化因子 可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位 并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞 修复及补充损伤的神经细胞 由于缺血 缺氧导致的血管内皮细胞 胶质细胞的损伤 使局部通透性增加 另外在多种黏附分子的作用下 神经干细胞可以透过血脑屏障 高浓度的聚集在损伤部位 2 神经干细胞可以分泌多种神经营养因子 促进损伤细胞的修复 3 神经干细胞可以增强神经突触之间的联系 建立新的神经环路 移植细胞的功能可能有三方面作用 1 用移植的细胞取代受损的细胞 释放神经递质 重建神经回路 2 利用移植细胞产生神经营养或保护因子 保护受损的神经细胞 使其免于死亡 长出轴突 并与次级神经元形成突触 3 三是用移植细胞形成中间神经元 改变脑组织对损伤的反应 帮助重建神经回路 4 免疫抑制作用 通过旁效应机制抑制炎性损害 抗炎 抗凋亡作用 具体机制不清楚 二 神经干细胞移植研究 二 神经干细胞移植 1 多潜能NSCS移植实验一 成年脊髓来源的NSCS在移植入海马齿状回后分化为神经元 但当被移回成年脊髓后不能产生神经细胞 实验说明 3 局部微环境而不是神经干细胞自身的内在特性决定了移植细胞的最终命运 神经干细胞的内在分化潜能不足以克服局部环境对移植细胞的影响 2 成年哺乳动物某些脑区仍然保留了诱导干细胞分化的信号系统 而脊髓在成年后却丧失此功能 1 成年哺乳动物脑中分离的干细胞仍具有多向分化的潜能 二 神经干细胞移植 实验二 胚胎和成年来源的神经干细胞移植入成年个体非神经发生区域 如小脑 纹状体和脊髓 时 主要分化为神经胶质细胞 而多潜能神经干细胞被移植入受损的脊髓时 主要分化为星型胶质细胞 而体外表现出多样性分化被明显抑制 局限性分化机制不清楚 可能是驱动NSCS向神经元方向分化的分子信号在受损的脑 脊髓中不表达 也可能向神经胶质方向分化的信号占主要 二 神经干细胞移植 2 神经元限制性的前体细胞移植 neuronal restrictedprecursors NRPS 利用药理学和分之生物学的方法诱导朝神经元方向限制性分化的NSC 可提高功能性神经元的分化率 二 神经干细胞移植 3 神经干细胞移植治疗的方法选择立体定向局部注射 脑立体定位仪 缺点 靶点不明确 难以确定注射部位 多点注射可能造成新的损伤 以及移植细胞有限的迁移能力造成治疗效果不佳 静脉注射 操作简单 避免新损伤 脊髓蛛网膜下腔注射 利用在脑损伤时血脑屏障的破坏和损伤脑组织释放一些趋化因子的作用 利于神经干细胞透过 高浓度的聚集在损伤部位 二 神经干细胞移植治疗 4 神经干细胞移植治疗的时间选择实验表明 移植物在各阶段的脑损伤灶内均能存活 但急性期存活率低于亚急性或晚期 其原因可能是 宿主脑组织病变区的急性渗出 水肿及变性坏死等过程 使移植细胞得到的营养减少 释放某些神经毒性物质 急性期建立血供困难 急性期产生的营养因子浓度低 影响移植的因素 移植的时机 第7 9天移植移植细胞大部存活 并分化成不同类型神经细胞 此时急性炎症已消退 微环境进入修复阶段 有神经生长 营养因子的表达及微血管的形成 利于移植细胞的存活 移植的途径 无明显差异移植细胞的数量 实验表明 对神经行为功能改善方面有明显的剂量依赖性 低于一定数量不会改善功能 中等密度移植较好 106个 营养因子 将外源性GDNF BDNF EGF FGF NGF等神经营养因子通过脑室 损伤部位注射或同时植入修饰后表达分泌生长因子的神经细胞 可明显促进移植效果联合移植 与其它细胞或细胞因子联合使用 5 体内移植干细胞的生物学检测 利用体外培养的干细胞进行神经损伤修复和退行性疾病的治疗面临的问题是 培养足够量的细胞用于移植 如何标记移植细胞 移植细胞的数量 移植后细胞的存活率 如何鉴别移植的干细胞从移植部位迁移到损伤部位 移植后干细胞如何分化为有功能的神经细胞 进行修复和功能重建 目前用5 Brdu和绿色荧光蛋白标记移植的前体细胞 GFAP 胶质嗜酸性蛋白 星形胶质细胞Nestin 神经干细胞 神经元进行鉴定 提高神经干细胞移植的成功率 移植入体内的神经干细胞存活率并不高 其主要原因 由于损伤后还存在局部炎症导致的后期效应 使得移植的NSCS不易存活 损伤区周围的细胞释放有毒物质影响干细胞存活和分化 损伤时间过长 神经营养因子分泌量下降及胶质瘢痕形成后不利于神经干细胞生长 因此改善移植细胞的局部生存微环境 选择适宜的移植时间非常重要 脑损伤6个月内 如文献报道从第9天开始 一周一次 连续4周 神经干细胞移植的方法依据神经干细胞能够向病变神经系统部位趋行 聚集的生物学特性 目前动物实验及临床应用中所使用的干细胞移植途径主要包括局部注射移植 经脑脊液注射移植 经血液循环注射移植 通过静脉注射移植 通过椎管注射移植 通过介入方法直接移植到病变部位动脉血管 神经干细胞移植途径 一 局部注射移植1 立体定向脑内注射移植动物实验和临床研究多采用 应用CT MRI扫描定位后 图像象输入计算机 利用计算机规划移植靶点 手术路径 局部麻醉后 颅骨钻孔 插入探针 微量泵泵入神经干细胞 优点 定位准确 时间短 创伤小 局麻下利于术者检查患者配合情况 及时观察治疗反应 把干细胞全部集中到病灶及其周边发挥治疗作用 神经功能改善迅速 直接 适应症 病灶比较局限的疾病如脑出血后遗症 脑外伤后遗症 局灶性脑梗塞等 或具有集中神经功能核团支配的神经功能退行性疾病如帕金森症等 缺点 1 脑内NSCs移植的成功率较低 这是因为脑损伤部位是一处不良的局部微环境区域 植入的NSCs有可能被激活的小胶质细胞和巨噬细胞所清除 2 有容积占位效应 致使NSCs移植量有限 这也是导致移植成功率降低的因素之一 3 经脑内移植还可导致局部NSCs过度聚集 不利于NSCs的分化 4 头部穿刺手术 虽然创伤较小 但仍存在穿刺出血的风险 许多患者不愿意接受 2 脊髓局部注射移植是目前治疗脊髓损伤的动物实验和临床研究多采用的干细胞移植方法 该技术主要是在脊髓损伤的节段进行手术 依次切开皮肤 肌肉 韧带 咬除受伤节段的部分椎板 剪开硬脊膜然后在受伤脊髓节段上下两端注射干细胞 优点 移植的细胞分布在损伤脊髓两端发挥作用 同时手术可以起到减压的作用 促进部分脊髓功能的恢复 缺点 创伤大 存在出血的风险 此外手术本身对脊髓是一次新的损伤有可能加重神经功能的缺失 二 经脑脊液途径移植1 腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植是目前另一种较多采用的移植方法 该方法是利用腰椎穿刺技术 于腰椎3 5椎间隙 置入穿刺针达到蛛网膜下腔 注入神经干细胞 原理 移植的细胞可以顺着脑脊液的循环途径流遍整个大脑和脊髓 可在宿主蛛网膜下腔中保持贴附 增殖和分化的能力 无论哪里有病灶 细胞都可以到达适应症 适合于病变较为广泛的神经功能疾病的治疗 例如脑炎后遗症 脑发育不良等疾病 优点 创伤很小 每次操作只需要十多分钟 病人始终处于清醒状态 缺点 1 植的干细胞被分散到整个大脑和脊髓 干细胞迁移 趋行到什么部位难以控制 治疗效果没有定向脑内注射明确 2 干细胞需要顺着脑脊液循环至大脑 路径较长 且需通过脑脊液 脑屏障 细胞损失较多 3 干细胞直接进入脑脊液中 为环境完全不同于体外培养的环境 干细胞存活的数量仍存在疑问 2 脑室穿刺注射移植部分动物实验和临床研究采用 该方法是给予患者侧脑室穿刺后 经穿刺针注射神经干细胞 原理 移植神经的干细胞可以特异性的迁移至脑损伤区域优点 1 干细胞可以直接到达脑室系统 循环至整个神经 2 移植点位于高位 路径较短 干细胞损失较少 3 植入细胞可远离损伤环境 同时避免损伤区的不良微环境影响移植细胞的成活 从而提高植入细胞的存活率 4 避免经脑内移植时的容积占位效应 增加植入细胞的数量 5 脑室内环境也为植入的NSCs提供了良好的迁移发育和定向分化的场所 有利于脑室植入细胞在内源性NSCs的迁移途径引导下 广泛快速地到达脑内损伤区 二 经脑脊液途径移植 2 脑室穿刺注射移植缺点 1 要经过脑脊液循环到达病灶区 需要移植的细胞数量要增加 2 脑室穿刺创伤较腰椎穿刺大 有穿刺出血的风险 脑室穿刺细胞移植与腰椎穿刺细胞移植的治疗原理和效果应该是基本相同 如果此移植途径可行 在临床上可以直接通过腰椎穿刺蛛网膜下腔注射进行细胞移植 二 经脑脊液途径移植 三 血液循环途径移植 1 静脉内注射移植 目前仅见于动物实验的文献报道 个别医院也在应用该方法 但尚未正式报道 该方法是使用静脉穿刺的方法 将神经干细胞滴入血液循环 干细胞通过血液循环到达神经系统 透过血脑屏障到达脑组织发挥作用 优点 是创伤小 容易被患者所接受 经静脉移植避免损伤正常脑组织 且可以通过反复多次移植来弥补到达病灶区NSCs少之不足 缺点 从外周静脉进入脑内需经长时迁移 最后进入脑内的细胞数量十分有限 从而导致移植成功率不高 从理论上来讲 大量的移植细胞没有进入所希望治疗的病灶区域 而是在血液循环中消耗掉了 加大移植细胞的数量的话 理论上可能有足够数量的干细胞进入病灶区域发挥作用 但同时会使治疗成本升高 2 动脉内注射移植原理基本与静脉内注射移植相同 主要是部分学者考虑通过直接将干细胞在供脑动脉内注射 可以减少干细胞在血液循环中的损失 提高干细胞的利用率 多采用颈内动脉穿刺的方法移植干细胞 优点 这样可以使移植的干细胞集中流到脑组织内部 减少细胞耗损 缺点 可能使老年患者动脉壁上的血栓脱落形成新的脑血栓 以及可能形成夹层动脉瘤 以上几种干细胞移植途径各有优缺点 均为干细胞的动物实验及临床研究提供了移植方法 很难评价各种方法的优劣 而应该在各种方法的完善上进一步进行研究 掌握每种方法的适应证 必要时可以两种或两种以上方法联合应用 以达到最好的治疗效果 三 血液循环途径移植 需要转染基因的原因 1 内源性神经干细胞的数量不足 损伤局部的微环境不适宜神经细胞的再生 单纯补充干细胞的数量是不够的 可以通过转基因技术 将编码神经营养因子等的基因片段导入神经干细胞中 使其在移植部位进行表达 改善局部微环境 以维持细胞的生存和增殖 2 为了达到某种特殊的治疗目的 也需要对移植的神经干细胞进行基因修饰 使其在局部产生特殊的蛋白质 如用于治疗中枢神经系统肿瘤时 让其产生抗癌药物 治疗帕金森病时 让其产生多巴胺等 3 一些大分子物质如神经生长因子 NGF 脑源性生长因子 尽管有治疗作用 却不能通过血脑屏障 其治疗作用受到限制 基因治疗的载体 神经干细胞具有转基因的可操作性 可携带多个外源性基因 相对于其它载体具有以下优点 潜在的分化能力 转化为神经元和神经胶质细胞 在结构上整合于宿主体内 无免疫源性发生能在脑实质内弥散较远的距离 迁徙性 弥补了病毒载体的一些不足以神经干细胞为载体转入神经生长因子 某些代谢酶等的基因 使其在脑内表达 主要用于治疗弥散性神经变性性疾病或中枢神经系统为主要病变部位的代谢性疾病 基因治疗的载体 应用举例 1 用NSC作载体 将编码特定神经递