MM_FS_CNJ_0350 出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0350出口贝类 麻痹性贝类毒素 鼠单位测定法MM_FS_CNJ_0350出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法1.适用范围本方法适用于出口海产双壳类贝肉，贝柱和其他可供食用部分的麻痹性贝类毒素的检验。2.定义麻痹性贝类毒素（PSP）：化学结构以石房蛤毒素（Saxitoxin）为代表的，摄食后可产生麻痹作用的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称。CF（conversion factor）：毒素转换系数。DF（dilution factor）：稀释系数。MU（mouse unit）：鼠单位。CMU（corrected mouse unit）：校正鼠单位。中位数：把变量值按大小次序排列，居于中间位置的那个数值就是中位数。3.原理概要本方法采用鼠单位测定，对PSP予以定量。鼠单位定义为：对体重为20g的小白鼠腹腔注射1mL贝类提取液后，在15min时杀死小鼠所需的最低毒素量。采用Saxitoxin作为毒素的标准品，将鼠单位换算成毒素的微克数。根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位，计算确定每100g贝肉内的PSP的微克数。所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素的总量。4.主要试剂和仪器4.1.主要试剂盐酸溶液：0.18molL，将15mL浓HCl用蒸馏水稀释至1L；盐酸溶液：5molL，将41.7mL浓HCl用蒸馏水稀释至100mL；氢氧化钠溶液：0.1molL，将4.6gNaOH溶于1L蒸馏水中；麻痹性贝类毒素（Saxitoxin）标准液：100gmL，经酸化，含有20的乙醇作为保护剂，冷藏时，无限期稳定；体重1921gICR品系的雄性健康小白鼠。4.2.仪器均质器；天平（感量0.5g）；离心机；pH计；秒表；玻璃器皿：烧杯、量筒、容量瓶、搅棒等；注射器（1mL）。5.试样的抽取与制备5.1.检验批以不超过100t为一检验批，同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、季节和规格等。5.2.抽样数量按各检验批的重量，依下表抽取样品：检验批的重量，t抽样点（件）数混合样品数10以下102115015351100204如为散装的应均匀抽样。5.3.抽样方法按5.2规定的抽样点（件）数，随机抽取样品。每5点（件）抽取的原始样品组成一个混合样（即检验样品）。其重量不少于2kg，装入清洁容器内，加封标记后，及时送交实验室检验。5.4.分析样品的采集分析样品要有充分的代表性，依受检贝类品种决定样品的采集量。取样个数不少于12个贝类个体，即从2kg混合样品中挑选良好的贝去壳，去壳肉量应达200g。对于个体过小的品种，则以去壳后肉量不少于200g来决定采集个数。新鲜贝类不能及时送检，按5.5.1方法将贝肉分离，将沥水后的200g贝肉放入100mLHCl（0.18molL）中，置于4冷藏保存（切勿冷冻），备检。5.5.试样制备5.5.1.牡蛎、蛤及贻贝用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集约200g肉置于10号筛子中沥水5min（不要使肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质。5.5.2.扇贝取可食部分用作检测。沥干及均质过程同5.5.1。5.5.3.贝类罐头将罐内所有内容物（肉及液体）倒入均质器充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集沥下的液体，分别称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质。5.5.4.用酸保存的贝肉沥去酸液，分别存放贝肉及酸液，将沥干的贝肉充分均质。5.5.5.冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）呈半冷冻状态，按5.5.1方法开壳、淋洗、取肉、均质。5.5.6.贝肉干制品干制品可于HCl（0.18molL）溶液中浸泡（冷藏），按5.5.4方法沥干、均质。5.6.试样保存上述5.5中经均质处理的样品如不能及时检测，可取100g已均质贝肉加入100mLHCl（0.18molL）溶液，置于4冷藏保存（尽可能及时检验）。6.过程简述6.1.PSP标准工作液的配制6.1.1.用移液管取1mL（100g SaxitoxinmL）标准液于100mL容量瓶中，加入用HCl酸化至pH3的蒸馏水并定容。该液为1g SaxitoxinmL，pH在2.04.0之间。在34下能稳定数周。6.1.2.分别用10、15、20、25和30mL水稀释10mL浓度为1gmL标准液，稀释液的pH应为24。6.2.中位数死亡时间的标准液选择将6.1.2的各种浓度的稀释液各1mL腹腔注射数只小鼠，选择中位数死亡时间为57min的浓度剂量。如某浓度稀释液已可达到要求，还需以1mL水的增减量进行补充稀释试验。例如：用25mL水稀释的10mL标准液在57min杀死小鼠，还需进行2410和2610的稀释度试验。以10个小鼠为一组，用中位数死亡时间在57min范围内的二种（最好是三种）稀释度的标准液注射小鼠。记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。每只小鼠事先称重，精确到0.5g。记录注射完毕至死亡时间的最短间隔为5s，即7s校正为5s，8s校正为10s（见附录A）。6.3.毒素转换系数的计算计算用各种稀释液所注射的10只小鼠的中位数死亡时间。若某种稀释液注射的所有10只小鼠中位数死亡时间小于5或大于7min，则弃去该组结果；若另一种稀释液注射的10只小鼠中位数死亡时间在57min，即使某些小鼠死亡时间可能小于5或大于7min，也要使用该组所有数据。但是某组稀释液经注射后，10小鼠中有3只以上存活，则要再取10只小鼠进行重复试验。根据所选稀释液注射的10只小鼠中位数死亡时间为57min之间的死亡时间，由附录A分别查出鼠单位（MU），再由附录B查出小鼠的重量校正因子，两者相乘求得每毫升稀释液的校正鼠单位（CMU）。将所选稀释液每毫升实际毒素含量的微克数（以Saxitoxin计算）除以CMU值便得到毒素转换系数（CF），即CFgSAX.CMU。计算每组10只小鼠的平均CF值，再取其组间平均CF值，并以此为标准作常规检测。6.4.CF值定期检查如PSP检测间隔时间较长，每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠，重新测定CF值。如果一周有几次检测，则用中位数死亡时间57min的标准稀释液每周检查一次。测得的CF值应在原测定CF平均值的20范围内。若结果不符，用同样的标准稀释液另注射5只小鼠，综合先前注射的5只小鼠结果，算出CF值。并用同样的标准稀释液注射第二组10只小鼠，将第二组求出的CF值和第一组的CF值进行平均，即为一个新的CF值。重复检查的CF值通常在原结果的20之内。若经常发现有较大偏差，在进行常规检测前应调查该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。6.5.样品中PSP的提取取100g已均质的样品于称过重的800mL烧杯中，加100mLHCl溶液（0.18molL）或样品中沥得的酸液，充分搅拌，检查pH，pH应为2.04.0。若需要，可逐滴加入HCl（5molL）或NaOH（0.1molL）搅拌以防止局部碱化使毒素破坏。将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节已冷却混合物的pH至2.04.0。将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状，直至滗析分离时不产生大至堵塞注射针头的固体颗粒为止。必要时将混合物或上清液以3000rmin离心5min，或通过滤纸过滤。保留足以进行小鼠注射用的液体。6.6.小鼠试验将小鼠称重并记录重量。每个样品注射三只小鼠。对每只试验小鼠腹腔注射1mL提取液。注射要准确熟练，若有一滴以上提取液溢出就须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射完毕时间，仔细观察小鼠停止呼吸时所表明的死亡时间（到小鼠呼出最后一口气止），用秒表记录死亡时间。若小鼠的中位数死亡时间小于5min，则要进行稀释再注射另一组小鼠3只，以得到57min的死亡时间。若注射未稀释的样品后，1或2只小鼠的中位数死亡时间大于7min，则需注射至少3只小鼠以确定样品的毒力。如需稀释样品，要逐滴加入HCl（0.1或0.01molL），调节稀释液的pH至2.04.0。7.结果计算与判断7.1.PSP毒力的计算与判断根据小鼠的死亡时间，在附录A中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数MU。若试验动物重量小于19g或大于21g，则根据附录B查出重量校正系数。重量校正系数乘以该只小鼠的MU便得到CMU。计算该组小鼠的中位数CMU（将存活鼠的死亡时间视为大于60min或相当于小于0.875MU）。以中位数按下式计算便得到样品中PSP毒素的含量。gPSP100g肉中位数CMUmLCFDF200 （1）任何大于80g100g肉的值即被认为是有害的，对人类食用不安全。7.2.MU毒力的计算与判断取得麻痹性贝类毒素标准品有困难的实验室可使用鼠单位MU对检验结果予以计算与判断。按7.1求出该组小鼠的中位数CMU，然后求出100g贝肉的MU值。MU100g肉中位数CMUmLDF200 （2）任何大于400MU100g肉的值即被认为是有害的，对人类食用不安全。注：检验结果的仲裁以5.1为准。8.来源：SN 035295附 录 A麻痹性贝类毒素死亡时间-鼠单位的关系（补充件）表A1时间1）单 位时间1）单 位1001005001.921066.2051.891538.3101.862026.4151.832520.7201.803016.5301.743513.9401.694011.9451.674510.4501.64509.33558.426001.60151.542007.67301.48057.04451.43106.52156.067001.39205.66151.35255.32301.31305.00451.28354.73404.488001.25454.26151.22504.06301.20553.88451.183003.709001.16053.57301.13103.43153.3110001.11203.19301.09253.08302.9811001.075352.88301.06402.79452.7112001.05502.63131.03552.56141.015151.0004002.50160.99052.44170.98102.38180.972152.32190.965202.26200.96252.21210.954302.16220.948352.12230.942402.08240.937452.04250.934502.00300.917551.96400.898600.875注