分子生物学--细胞凋亡课件.ppt

细胞凋亡Apoptosis 主要内容 概述细胞凋亡的形态学变化和生化改变细胞凋亡的过程与调控细胞凋亡的发生机制细胞凋亡在疾病防治中的意义 细胞凋亡 科普诗 似秋叶的凋零 告别生命之辉煌 那难以计数的攻击 诱导 轻启着道道程序 逼细胞步步走向生命的末端 啊 活性氧处处肆虐 钙波涛惊石裂岸 线粒体把生命之光一点一点拧淡 危难中的细胞啊 你沉稳不乱 DNA片片切割 化云梯直通天堂 细胞体分团相聚 把生命的凝重浓集在小体上 分别了朝夕相处的伙伴 再见了快乐美好的时光 这一切的一切又融入临近的胞体 腾出的空间再写生命的篇章 2001 10 1试作 一 概述 细胞凋亡 apoptosis 是1972年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的 凋亡 一词来自希腊语 apo意为 分离 ptosis指花瓣或树叶的脱落 凋亡 是由这两个词组合而成 意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样 一 细胞凋亡研究简史 1 凋亡概念的形成 2 细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段 1972 1987 1977年 人们注意到在生理或病理性刺激条件下 淋巴细胞发育过程中的凋亡现象 1980年 Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化 总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征 包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等3 细胞凋亡的分子生物学研究阶段 最近几年1989年 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用 1991年 Ellis首先发现了线虫 C elegans 体内Ced 3 4两个基因与PCD的发生密切相关 随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因4 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段细胞凋亡的研究 其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明 以及新疗法的探索及问世 2002年10月7日英国人悉尼 布雷诺尔 美国人罗伯特 霍维茨和英国人约翰 苏尔斯顿 因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖 他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡 而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律 SydneyBrenner H RobertHorvitz JohnE Sulston THENOBELDIPlOMA 2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式 瑞典斯德哥尔摩音乐厅 SydneyBrennerreceivinghisNobelPrizefromHisMajestytheKingattheStockholmConcertHall Photo HansMehlin Nobele Museum 二 细胞死亡的方式 细胞坏死细胞凋亡细胞程序性死亡 1 细胞坏死 necrosis 是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应早期表现为细胞膜破坏 线粒体肿胀溶酶体破裂 细胞内容物流出 引起炎症 坏死 坏死炎细胞浸润 细胞凋亡的概念 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程细胞凋亡的特点 细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体 凋亡小体内有结构完整的细胞器 溶酶体活性不增加 内切酶活化 DNA片断化 凝胶电泳图谱呈梯状 2 细胞凋亡 apoptosis 凋亡 3 细胞程序性死亡 细胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD 是一种基因指导的细胞自我消亡方式 PCD和细胞凋亡的区别在以下方面 PCD是功能性概念 凋亡是形态学概念 大多数PCD的最终结果是细胞凋亡 但细胞凋亡并非都是程序化的 PCD存在于胚胎发育过程中 细胞凋亡与细胞坏死的比较 一 细胞凋亡与细胞坏死的比较 二 细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶 主要是水解酶 蛋白酶与核酸酶 的作用 在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡 这与坏死时细胞质膜早期破损不同 在细胞凋亡过程中 质膜脂双层丧失二侧不对称性 磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面 从而导致被吞噬 三 线虫 C elegant 中的细胞程序性死亡 隐杆秀丽线虫 Caenorhabditiselegans Celegans 低等蠕虫 虫体透明 易于观察体内细胞形态的变化 线虫 成体959个细胞 但在发育过程中有131个细胞会注定发生PCDPCD发生时间 1h左右参与线虫PCD的基因 目前已知的有14个 Apoptosisisallaroundus 四 生理性细胞凋亡的作用 确保正常发育 生长在器官 组织的形成 成熟中发挥作用 细胞团具备复杂结构的组织器官 多余细胞的清除 生理性细胞凋亡的作用 维持内环境的稳定清除受损 衰老和突变的细胞 针对自身抗原T细胞的清除 子宫内膜周期性剥脱 发挥积极的防御作用 二 细胞凋亡的形态学变化和生化改变 微绒毛消失脱水空泡化 blebbing 固缩 condensation 出芽 budding 染色质边集 margination 凋亡小体 apoptosisbody 一 细胞凋亡的形态学变化 细胞首先变圆 随即与邻周细胞脱离 失去微绒毛 胞浆浓缩 内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合 核染色质密度增高呈半月形 并凝聚在核膜周边 核仁裂解 进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹 内涵物不外泄的细胞凋亡小体 被吞噬细胞或邻周细胞所识别 吞噬 或自然脱落而离开生物 不引起炎症反应和次级损伤 apoptosis 凋亡时细胞的形态学改变 凋亡过程与调控 空泡化 固缩 出芽 边集 凋亡小体 形态学特征 染色质边集 胸腺细胞 正常 凋亡 AcomparisonofnormalandapoptoticT cells 胸腺细胞 正常 凋亡 二 细胞凋亡的生化改变 DNA片断化 caspase激活 灭活凋亡抑制物 水解活性蛋白 水解结构蛋白 1 DNA的片段化 梯状条带形成核小体连接区被切开 染色质 2 内源性核酸内切酶激活及其作用 由一系列胞内信号转导环节激活 执行染色质DNA切割 3 凋亡蛋白酶 caspases 的激活及其作用 是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用 其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶 cysteine containingaspartate spicificprotease 至少有13个成员 第一个被发现的caspase是caspase 1 即哺乳类的ICE 1992 1993 后来证明ICE与炎症有关而在细胞的死亡中没有明显作用 线虫的CDE 3和ICE有一定的同源性 Caspase8的激活 需要FADD Fasassociatedproteinwithdeathdomain Caspase9激活 需要通过CARD caspase recruitmentdomain Apaf 1 细胞色素c ATP等多个因子的参与 细胞色素C Apaf 1和pro caspase9组成了 Apoptosome 凋亡体 caspases功能 灭活细胞凋亡的抑制物 正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态 而不出现DNA断裂 这是由于核酸酶和抑制物结合在一起 如果抑制物被破坏 核酸酶被激活 DNA就会被降解 片段化 现知Caspase可以裂解这种抑制物 水解蛋白质结构 细胞解体 形成凋亡小体如裂解核纤层 核纤层是由核纤层蛋白通过聚合作用形成的头尾相接的多聚体 由此形成核膜的骨架结构 是染色质得以形成并进行正常的排列 细胞凋亡时 核纤层蛋白被Caspase在一个近中部的固定位置裂解 从而使Caspase蛋白崩解 导致染色质的固缩 在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白 使其获得或丧失功能如灭活或下调DNA修复有关的酶 mRNA剪切蛋白等 三 细胞凋亡过程与调控 一 细胞凋亡的过程 cAMPCa2 神经酰胺 凋亡诱因 凋亡信号转导 凋亡基因激活 细胞凋亡 凋亡细胞清除 受体 死亡信号 DNase活化Caspases活化 DNA片断 凋亡小体形成 巨噬细胞吞噬 分解 apoptosis 凋亡过程与调控 凋亡过程 受体 cAMPCa2 神经酰胺 凋亡相关基因激活 信号转导 细胞膜 细胞核 Dnase激活Caspases激活 apoptosis 凋亡过程与调控 凋亡过程 DNase激活 Caspases激活 凋亡细胞的清除 凋亡执行 二 细胞凋亡的调控 1 细胞凋亡相关因素 诱导性因素 大量糖皮质激素 淋巴细胞凋亡射线 高温 强酸 强碱 乙醇 抗癌药物CTL分泌粒酶HIV CD4 细胞凋亡 抑制性因素 细胞因子 IL 2 NGF 激素 ACTH 睾丸酮 雌激素 金属阳离子 Zn2 药物 苯巴比妥 半胱氨酸酶抑制剂 病毒EB病毒 牛痘病毒 凋亡信号转导系统特点 多样性 不同种类的细胞系统不同 偶联性 与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性 多因素 共用同一系统触发 多途性 同一诱导因素启动多条信号转导途径 2 细胞凋亡信号的转导 腺苷酸环化酶 钙调素 Ca2 cAMP 谷氨酰胺转移酶 PKA 转录因子 神经酰胺 SPP AP 1 S期 抗凋 caspase H1组蛋白 MAPK MAPKK Raf 1 Ras PTK 分化 PKC 二酰甘油 Tc R 糖皮质激素 研究较多的系统 依据 细胞凋亡时胞内游离Ca2 浓度显著上升 用Ca2 载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2 水平 B淋巴细胞凋亡 用Ca2 络合剂降低胞内Ca2 水平 阻止细胞凋亡 1 胞内Ca2 信号系统 Ca2 为第二信使 2 cAMP PKA信号系统 cAMP为第二信使 依据 双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡 糖皮质激素使cAMP上升cAMP 激活PKA 使靶蛋白某些氨基酸 苏 丝AA 残基磷酸化 改变蛋白质功能 3 Fas蛋白 Fas配体信号系统 Fas蛋白 细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白 Fas配体 抗Fas 细胞凋亡机制 Fas蛋白 Fas配体 抗Fas 神经鞘磷脂酶活性 产生神经酰胺 蛋白激酶激活 细胞凋亡 Fas蛋白 抗Fas TNF 激活ICE样caspase 降解H1组蛋白 染色体松驰 DNA暴露内切酶位点 通过Ca2 信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡 Fas又称CD95 APO 1 是由325个氨基酸组成的受体分子配体诱导受体三聚体化 然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物 Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域 DD deathdomain 死亡结构域相聚成簇 吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白 它由两部分组成 C端 DD结构域 和N端 DED 部分 FADDN端通过DED区 deatheffectordomain 与无活性的半胱氨酸蛋白酶8 caspase8 酶原结合 激活Caspase 8 进而引起随后的级联反应 即Caspases Caspase 8自剪切活化 激活Caspase 3 Caspase 7Caspase 3激活Caspase 6 Caspase可降解结构蛋白 信号蛋白 转录调控蛋白 周期蛋白等等 Caspase还可降解CAD的调节蛋白 释放出CAD CAD进入细胞核降解DNA CAD为caspase activatedDnase 存在于胞质中 死亡受体属于肿瘤坏死因子受体 TNFR 超家族成员 目前至少发现有5种死亡受体 分别为Fas TNFR1 DR4 DR5 DR3 死亡受体通路是细胞凋亡的重要途径之一 它们位于细胞膜表面 具有相似的结构 细胞外有富含2 5个半胱氨酸的重复序列 并具有特异性地与其配体相结合继而诱导凋亡的死亡信号激发域 胞内含有转导细胞凋亡信号必须的死亡功能区 deathdomain DD 而且各成员的死亡结构域之间具有很高的同源性 对应于Fas和TNFR1的配体分别是FasL和TNF DR4和DR5对应的配体是APO 2L DR3的相应配体是APO 3L 死亡受体 ThecombinationofTNFRwithTNF 死亡受体 FAS TNFR DR3 DR4 DR5 等 在死亡因子 FasL TNF APO 3L APO 2L 等刺激下诱导凋亡 1 FasL Fas FADD caspase8 途径 2 TNF TNFR1 TRADD FADD caspase8 途径 3 DR3L DR3 TRADD FADD caspase8 途径 4 APO 2L DR4 5 caspase8 途径 死亡受体途径图解 4 神经酰胺信号系统 神经酰胺 神经鞘磷脂 SM 在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质 介导细胞凋亡的依据 用天然神经酰胺处理u937白血病细胞 诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因 电离辐射 TNF Fas抗原 糖皮质激素 5 二酰甘油 蛋白激酶C PKC 信号系统 二酰甘油 磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质 依据 活化的PKC 1可诱导u937白血病细胞凋亡 抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡 6 酪氨酸蛋白激酶系统 生长因子或细胞因子 激活酪氨酸蛋白激酶 靶蛋白酪氨酸磷酸化 Ras蛋白激活 通过Raf 1 MAPKK MAPK 蛋白质磷酸化 细胞分化生长因子或细胞因子撤除 不能激活酪氨酸蛋白激酶系统 细胞凋亡 1 死亡基因 ced 3 ced 4 ced 9 Ced 3和Ced 4的作用是诱发凋亡 Ced 9抑制Ced 3 Ced 4的作用 三 凋亡相关基因 线虫细胞凋亡的基因 保守性高 在哺乳动物中相应同源物 Ced 3 ICE ced 4 apaf 1 ced 9 bcl 2 2 吞噬基因 参与吞噬 ced 1 ced 2 ced 5 ced 6 ced 7 ced 8和ced 10 3 核酸酶基因 nuc 1 4 某些特殊类型细胞的死亡基因 ces 1 ces 2 抑制凋亡基因 bcl 2促进凋亡基因 fas P53 bax双向调控基因 c myc bcl x 哺乳动物细胞凋亡的基因调控 1 Bcl 2 抑制凋亡基因 细胞凋亡抑制基因 名称来源于B细胞淋巴瘤 白血病 2 B celllymphoma Leukemia 2 bcl 2 bcl 2能够编码bcl 2 26KD 和bcl 2 22KD 两种蛋白质 是膜的结合蛋白 主要存在于线粒体外膜 核膜及部分内质网中 Bcl 2和C elegans中的ced 9有很高的同源性 Bcl 2的功能是阻遏细胞凋亡延长细胞的寿命 而不是刺激细胞的增殖 Bcl 2抗凋亡机制 直接的抗氧化 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 细胞色素C AIF 抑制促凋亡的Bax Bak细胞毒作用 抑制Caspases激活 维持细胞钙稳态 线虫C elegans和哺乳类细胞的死亡途径比较 Bcl 2基因家族有众多成员 如Mcl 1 NR B A1 Bcl w Bcl x Bax Bak Bad Bim等它们分别既有抗凋亡作用 也有促凋亡的作用Bax是Bcl 2家族中参与细胞凋亡的一个成员 当诱导凋亡时 它从胞液迁移到线粒体和核膜 可促进细胞凋亡多数成员间有两个同源区域 在介导成员之间的二聚化过程中起重要作用 Bcl 2成员之间的二聚化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式 Bcl x由于mRNA剪接方式不同 可产生两种大小不同的Bcl x分子 Bcl xL和Bcl xS大分子Bcl xL含有两个保守的同源区 BH1 BH2 和Bcl 2相似 可以抑制细胞凋亡小分子Bcl xS缺少两个保守的同源区 促进细胞凋亡 2 Bcl x 双向调控基因 3 c myc 双向调控基因 c myc是调控细胞周期的主要基因之一 Myc蛋白是一种转录因子 其氨基端具有反式激活结构域 羧基端具有螺旋 环 螺旋亮氨酸拉链结构域 介导聚合与特异的DNA序列结合 c myc基因表达在与其它致癌因素同在时为增殖作用 与其他抑癌因素共存时 就反过来导致细胞死亡 4 Fas 细胞表面受体 跨膜蛋白 伸向胞浆部一段与TNF 受体相似 高度同源 Fas抗体诱导凋亡 模拟配基作用 启动 死亡受体介导的信号途径 mFasL cell membrane boundFasL sFasL solubleFasL 死亡受体 FAS TNFR DR3 DR4 DR5 等 在死亡因子 FasL TNF APO 3L APO 2L 等刺激下诱导凋亡 1 FasL Fas FADD caspase8 途径 2 TNF TNFR1 TRADD FADD caspase8 途径 3 DR3L DR3 TRADD FADD caspase8 途径 4 APO 2L DR4 5 caspase8 途径 死亡受体途径图解 5 P53 野生型诱导凋亡 在G1期发挥卡点功能 有缺陷DNA 启动修复 失败 启动凋亡P53 molecularpoliceman Amodelforthefunctionofp53 G1 S G2 M CyclinA CDK CyckinA CDK1 CyclinB CyclinD p53 Bax Bcl 2 molecularpoliceman BlockingIGF R 四 细胞凋亡的发生机制 1 氧化损伤 活性氧氧化损伤生物大分子形成氧化应激 机制 1972年 Demopoulos证实了氧自由基 oxygenfreeradical OFR 在脑缺血中对内皮细胞损伤起重要作用 目前越来越多的证据表明OFR参与了细胞凋亡的发生 自由基及氧衍生自由基是具有未配对电子的原子 原子团及分子 是参与人体内氧化还原反应最重要最广泛的反应成分 氧自由基 DNA损伤 P53 活化聚ADP核糖转移酶 引起NAD耗竭 ATP 膜损伤 过氧羟基24碳四烯酸诱导 激活Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 膜透性 Ca2 内流 活化Fas 加速凋亡相关基因表达 氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节 2 钙稳态失衡TNF 抗CD3抗体 引起细胞凋亡是钙依赖性过程 钙稳态失衡引起凋亡的机制 激活Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶 酰基转移 细胞骨架蛋白分子间交联 凋亡小体形成 激活与凋亡有关的核转录因子 Ca2 促使核小体间酶切位点暴露 3 线粒体损伤线粒体是真核细胞的重要细胞器 是动物细胞生成ATP的主要地点 线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化 与此同时 导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和 或跨膜电位 线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成ATP 合成的ATP通过线粒体内膜ADP ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质 参与细胞的各种需能过程 超微结构基本正常 功能明显下降 线粒体内膜通透性增大 且跨膜电位 m 下降 能量合成明显 线粒体损伤 1 线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系 近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活 也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面 而一旦线粒体跨膜电位耗散 细胞就会进入不可逆的凋亡过程 2 线粒体通透性转变孔道 在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位