组织免疫共沉淀方法

论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于后续实验。或1.使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2.将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80C以备后用。 3.每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 4.用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4C缓慢摇动2小时 5.12000rpm 4C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。主要步骤：1.每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时 2.加100 l Preotein A/G agarose beads， 4C缓慢摇动10-30分钟 3.14,000 x g 4C离心10分钟 4.取上清，弃沉淀 为提高蛋白回收率，可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次，所得上清和前面的合在一起Note：要确保最大可能将正常血清（或无关Ig）从标本中去除。第三步：免疫沉淀1.取10-500 g细胞裂解物，加入推荐量的抗体：抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参考以下数据：. o多抗血清：1-5 l o亲和纯化的多抗：1 g o腹水（单抗）：0.2-1 l o培养上清（单抗）：20 -100 l 2.4缓慢摇动孵育1h到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力 3.同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠：根据抗体类型选择合适的beads（参考附表2），如果IP抗体是IgM：不使用protein-A/G beads，直接使用Goat anti Mouse IgM beads。 4.加入混匀的70-100ul protein-A/G beads，4缓慢摇动4h（根据具体实验优化孵育时间) 5.2500rpm(约1000g) 4C离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。 6.用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。 7.最后一次洗涤后，去除上清，加入25-50ul 2电泳上样缓冲液，95-100C煮沸5分钟（将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80C保存。 Loading buffer是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液（up to 1 M）从抗体上洗脱下来。附1：免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围 Salts: 0-1 MDetergent, non-ionic: 0.1-2%Detergent, ionic: 0.01-0.5%Divalent cations: 0-10 mMEDTA: 0-5 mMpH: 6-91. 非变性裂解buffer：适用于抗原类型：可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别20 mM Tris HCl pH 8137 mM NaCl10% glycerol1% Nonidet P-40 (NP-40)2 mM EDTA4C 可保存6个月使用前加入：Protease inhibitors上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer 含有更强的变性剂，特别适用于核蛋白的提取。50mM Tris HCl pH 8150 mM NaCl1% NP-400.5% sodium deoxycholate0.1% SDS10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer（Detergent-free soluble protein lysis buffer）：一些可溶性蛋白不需要使用去污剂，只要使用该buffer配合机械性的破碎操作即可：如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作含有以下成分的PBS：5 mM EDTA0.02 % Sodium Azide4C 可保存6个月使用前加入：Protease inhibitors4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer: 有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解buffer，然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白1% SDS5 mM EDTA室温可保存1周使用前加入：Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml