高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留.doc

高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留 Linna Tu, William C. S. Tai,* Lu Chen, David K. Banfield高尔基的糖基转移酶是一种酶家族的有序的修改糖蛋白的具体方式蛋白。第二类组成，这些膜蛋白的特点是短期暴露细胞质氨基末端尾巴和一腔酶域。细胞质尾巴发挥本地化的糖基转移酶的作用，外壳蛋白复合物COPI泡介导的逆行运输也在高尔基内工作。然而，这些酶缺乏的尾巴能识别COPI序列。在这里，我们发现Vps74p绑定到在多数的酵母细胞质尾巴五聚体主题目前高尔基本地化的糖基转移酶，以及COPI。我们建议Vps74p保持稳定，高尔基州的糖基转移酶动态定位到COPI通过促进其纳入小泡。 在高尔基体的功能，作为新合成的蛋白质分拣中心和作为糖蛋白的翻译后修饰的位置。蛋白糖基化是发起的内质网（ER）。糖蛋白，然后经过由高尔基组本地化广泛的顺序糖基转移酶糖链伸长和阐述介导的。虽然他们独特的催化糖基化反应，并显示脑池的分布特点，高尔基居民糖基转移酶都是II型膜蛋白组成的短期暴露细胞质N末端（尾）组成一个单独得薄膜区，一个导向主干区域和催化结构域的腔。Avariety的功能已确定了影响这些酶（1-3）：在跨膜区（4-8），特定区的腔面向非催化区（6,8），催化域之间的相互作用（9，10）和细胞质 尾（11-13）。稳态这些酶的分布状态维持一个动态的过程，它涉及到从晚期高尔基到早期生理池的检索，以及与高尔基和内质网，于是他们过境回到池对它们的功能（14，15 ）。虽然糖基转移酶的功能，直接的一个特定的酶一池或另一稳态变化，大概外壳蛋白复合物（COPI），小泡是由其中这些酶大部分被回收（14，16的主要手段） 。然而，高尔基居民糖基转移酶缺乏规范COPI在其细胞质尾巴结合基序，我们设法查明的蛋白质，可以结合 这些酶的尾巴，COPI可以促进其纳入小泡。我们确定了一个基本与高尔基删除相关的杀伤力居民圈套遗传屏幕前部抑制Vps74p（水溶性N -乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体），Sft1p，高尔基内的（17）逆行运输所需的一种蛋白质。 Vps74p是一个蛋白质家族，其中包括哺乳动物蛋白GPP34（GmX33a）和GPP34R（GmX33b）（18-21）的成员。虽然VPS74删除了对酵母细胞生长无明显影响，vps74D细胞已知非分类的羧肽酶Y，这说明 Vps74p参与蛋白质的运输（22）。我们注意到，vps74D缺陷细胞中的糖基（GPI）的处理锚定蛋白Gas1p。 Gas1p是修改增加了N -和O -连接碳水化合物，因为它穿越途中的高尔基体与细胞表面（图1A）（23）。在酵母中的Gas1p缺乏N中所涉及的酶菌株命运的比较和Oglycosylation揭示了在缺乏的A1 ,2 - mannosyltransferase，Kre2p（图1，A和B）（24）细胞类似的加工缺陷。我们考虑到Vps74p可能需要Gas1p运输和审查功能Gas1p贩运单体的可能性，红色荧光蛋白（Gas1p - mRFP）融合蛋白在细胞缺乏Vps74p（25）。然而，Gas1p位置在vps74D细胞mRFP是无法区别的，在野生型细胞（图1c）。 像GPP34（18），Vps74p是一个外周膜蛋白（图1，D和E），因此，只会有能力直接的物理与细胞质相互作用面向N端11个氨基酸的Kre2p。我们建造了一个混合体，其中蛋白质的Kre2p的细胞质和跨膜区域融合到N -端mRFP结束（Kre2CT - mRFP）。在野生型细胞，Kre2CT - mRFP是局部的无数小点在整个细胞质中，这部分的重叠，绿色荧光蛋白（GFP）融合到高尔基体，居民蛋白质，Rer1p（绿色荧光蛋白- Rer1p）（图1楼）。此外，由于不Rer1p（26）和Mnn9p糖基转移酶复合物（16），高尔基体和内质网之间的Kre2CT -绿色荧光蛋白循环通过COPI建立依赖机制（图中一）。在vps74D细胞，但是，Kre2CT - mRFP是定位于液泡（图1）。这种效果是不是因为在高尔基保留一般不足驻地膜蛋白，因为绿色荧光蛋白本地化Rer1p到高尔基没有受到影响。这些调查结果是一致的为Vps74p的Kre2p在高尔基体的动态保存的作用，并确定了N -端11个氨基酸的蛋白质为保留足够的调解。 酵母基因中，尤其是在糖基化涉及被删除细胞显示减少了在场的可行性calcofluor白（连续）。细胞缺乏VPS74更为敏感，连续超过kre2D细胞（图中二），所以我们推断，Vps74p调解可能增加糖基转移酶的高尔基本地化。当VPS74从表达Mnn9 -绿色荧光蛋白，Mnn2 -绿色荧光蛋白，或Ktr6CTGFP菌株删除，这些蛋白的确非局部化，要么一泡状烟雾（Mnn9 - GFP）的，或对液泡（Mnn2 内腔 - GFP和Ktr6CTGFP） （图2A）条。对齐的N端 对酵母糖基转移酶家族成员细胞质尾巴暴露了一个semiconserved motif (F/L)-(L/V)-(S/T)（27）在 对家庭的一些成员的（表1）细胞质尾巴。我们取代Phe4丙氨酸Leu5 - Ser6（滑膜）在Kre2p和评估的命运 关于本地化的kre2这些替换（AAA6）的CT -绿色荧光蛋白，以及对突变全长蛋白的能力，kre2（AAA6），来处理 Gas1p在kre2D细胞。 kre2（AAA6）的CT -绿色荧光蛋白是非局部化对在野生型细胞（图2B条液泡内部），和细胞表达他们对酶的唯一来源kre2（AAA6）来自缺乏KRE2基因在细胞的功能相同的不能完全处理Gas1p（图2C型）。我们建议，在Gas1p加工缺陷有关的图的不稳定。 1。 Vps74p是需要Kre2p在高尔基保留。 （甲）的位置 和顺序的糖基转移酶在Gas1p参与行动 加工（29）。 （乙）vps74D细胞缺陷类似Gas1p处理 缺陷缺乏Kre2p细胞。相对位置完全处理，糖化Gas1p（mGas1p）和急诊室驻留Gas1p前体形式 （pGas1p）的说明。 （c）运输的Gas1p - mRFP到细胞表面，在vps74D细胞不受影响。比例尺，5毫米。 （四）Vps74p结合膜。全细胞提取物（WCEs）遭到了离心连续弹一点三零零万克（13K）和10万克（10万）和颗粒（P）和上清液（S）的受SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE电泳）和染色。 （五）Vps74p是一个外周膜蛋白。酵母WCEs提取裂解液与单（磅）或1海卫X100（Tx100），0.1M的碳酸钠pH值11.5（pH值），或1 M氯化钠（盐）在裂解液。 （六）Kre2CT - mRFP而不是绿色荧光蛋白，Rer1p是非局部化在vps74D细胞液泡流明。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24）。 DIC的，微分干涉对比。 Kre2p在缺乏Vps74p细胞。事实上，Kre2p明显减少丰富vps74D细胞，以及kre2丰富的野生型细胞非常相似vps74D细胞（图二维）到Kre2p的（AAA6）。此外，Gas1p处理kre2D细胞表达N -末端Kre2p杂交产生的蛋白质含有类似图案滑膜糖基转移酶同Anp1异常（表1）是从野生型细胞（图3a区分）。进一步的证据表明，类似主题的财务和后勤系统是很重要的识别获得由Vps74p从酵母双杂交实验，其中野生型或滑膜丙氨酸取代胞质尾的Kre2p kre2C3（AAA6）是用来评估Vps74p约束力。虽然Vps74p是能够绑定到野生型的Kre2p胞质尾序列，发现没有互动和kre2C3之间Vps74p（AAA6）（图3B）款。 Vps74p直接绑定的Kre2p胞质尾，和FLS主题替换减少约束力 （图3C和图。三）。 该Anp1-Kre2混合蛋白恢复Gas1p加工kre2D细胞（图3a）的无力令人费解，因此我们认为有可能承认的Vps74p glycosyltransferas中，除了滑膜样主题。最近的一项研究表明，一个在Mnn9p回收二元序列从高尔基重要作用，内质网（13），和我们的酵母双杂交化验，Kre2p稳定性研究和活细胞成像实验的支持，为KR8肽要求在Vps74的Kre2p（图四）依赖保留。此外，我们发现没有滑膜样内残留的要求极样Kre2p主题，而F4和L5，是必不可少的结合 Vps74p（图五）。因此，Vps74p关于酵母高尔基体结合位点，符合居民的糖基转移酶的(F/L)-(L/I/V)-X-X-(R/K)的一个主题是在16 高尔基居民酶的存在（见表1）。为了测试这项建议的有效性，我们研究了Mnn5命运绿色荧光蛋白，其中包含一个序列，符合共识（LIXXK6）在vps74D细胞。与我们的预测，Mnn5 -绿色荧光蛋白相一致的是非局部化在这些细胞中（图六）液泡流明。 Vps74p可以促进或阻止从高尔基这些酶顺贩运或协助其通过高尔基回收池或从高尔基体到急诊室，在这个过程通过COPI大衣（图中一）糖基转移酶介导高尔基保留。为了区分这些可能性，我们研究了Kre2CT命运绿色荧光蛋白在细胞中的组成性高表达Vps74p。我们推断，如果Vps74p运作在急诊室回收途径，表达的蛋白质可能将转向稳定的Kre2CT态分布，从高尔基体到内质网绿色荧光蛋白。这确实是如此; VPS74表达了对稳定的Kre2CT国家定位的影响，绿色荧光蛋白是不是因为在急诊室块或间接出口到逆行运输一般加速度（图三维）。 Vps74p -绿色荧光蛋白在Kre2CT的逆行运输作用也得到了我们的基因研究。除了VPS74，我们还发现基因编码的高尔基囊泡大衣复杂COPI或基板（图七）组件。由于Sft1p是在高尔基（17）逆行运输需要，我们推测，作此sft1D细胞缺乏这些基因表达的补偿。此外，观察基因之间的相互作用和VPS74缺陷突变体在ER -高尔基贩卖（图七）。 鉴于Mnn9p复杂（16）和Kre2CT -绿色荧光蛋白（图中一）周期的电脑操作员之间的高尔基体和ER -依赖性，我们认为有可能Vps74p可能功能的电脑操作员共同调解回收图2。VPS74的删除导致非局部化和高尔基一个子集 糖基转移酶的降解。 （甲）Mnn2 -绿色荧光蛋白，Mnn9 -绿色荧光蛋白，并Ktr6CT -绿色荧光蛋白是vps74D细胞的非局部化。 （乙）氨基酸的替换在Kre2胞质尾FLS6序列kre2（AAA6）的CT -绿色荧光蛋白结果的蛋白质非局部化。 （A和B）比例尺，5毫米。 （丙）细胞表达作为其Kre2p的唯一来源kre2（AAA6）有缺陷的Gas1p处理。 （丁）kre2（AAA6）是不稳定的vps74D细胞。 （+）或（ - ）表示h后内切糖苷。在糖化（糖）和deglycosylated（去糖）的Kre2p形式，见箭头。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24）。WT,野生型。表1在酵母细胞质尾巴氨基酸序列高尔基居民糖基转移酶（27）。滑膜样在突出的斜体字中。糖基转移酶轴承推定Vps74p结合，(F/L)(L/I/V)-X-X-(R/K)主题突出显示粗体和他们的相应的主题是强调和斜体字中。 酶氨基酸序列的胞质尾 Kre2 MALFLSKRLLR Ktr1 MAKIMIPASKQPVYKK Ktr2 MQICKVFLTQVKK Ktr3 MSVHHKKKLMPKSALLIRKYQKGIR Ktr4 MRFLSKRILK Ktr5 MLLIRRTINAFLGCIH Ktr6 MHVLLSKKIAR Ktr7 MAIRLNPKVRRFLLDKCRQKR Yur1 MAK Mnt2 MRRKNR Mnt3 MLKSLKSRRLILKR Mnt4 MVLRIRRIKK Mnn1 MLALRRFILNQRSLR Mnn2 MLLTKRFSKLFK Mnn4 MLQRISSKLHRRFLSGLLRVKHYPLRR Mnn5 MLIRLKKRK Mnn9 MSLSLVSYRLRK Anp1 MKYNNRKLSFNPTTVSIAGTLLTVFFLTR Hoc1 MAKTTKRASSFRR Gnt1 MRLISKRRIR Och1 MSRKLSHLIATRKSK 糖基转移酶。与此假说相一致，Sec26p（bCOP）依赖于Vps74p因为它有能力支持sft1D细胞生长 （图S8A），并Vps74p势必被膜（图3），以及对Sec26p和Ret2p（dCOP）主干地区体外混合实验（图S8B 和图3）。图3 Vps74p结合的糖基转移酶的高尔基体和细胞质尾巴被膜。 （一）糖基转移酶- Kre2p嵌合体轴承滑膜样图案恢复kre2D细胞Gas1p处理。 （二）在Kre2p胞质尾FLS6序列需要与Vps74p相互作用的酵母双杂交法。 AD和BD分别涉及到GAL4的活化和结合域。 （三）Vps74p直接绑定的Kre2p胞质尾。 （顶部）免疫印迹5连接蛋白;（中，下）20的蛋白质的投入。 （图）量化的结果（指 标准差）。一个kre2C3融合蛋白（AAA6）与谷胱甘肽- S -转移kre2C3（AAA6）GST（26.4 18.6）和GST（0.1 0.3）。 （四）VPS74表达再分配Kre2CT从高尔基体到内质网绿色荧光蛋白。指向突出Kre2CT本地化绿色荧光蛋白。比例尺，5毫米。 （五）GST-Vps74p结合被膜从酵母WCEs。GST-Vps74p的被膜表面为7.5 0.4（指 标准差）为最大的GST。 （六）Vps74p结合标准长度的GST-Ret2p和主干网（1氨基酸372）GST-Sec26p.（前，左）谷胱甘肽珠纯化培养后，组氨酸6标签的Vps74p蛋白1 输入。箭头表示的重组蛋白的立场。Vps74p免疫组织化学染色势必GST融合蛋白。输入的Vps74p与GST融合蛋白混合蛋白的相对含量列于1 和10 。 （七）GPP34R在vps74D抑制细胞的Kre2p不稳定。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24）。 我们建议，Vps74p的功能是作为高尔基与内质网的运输泡组成部分是COPI表面受体的糖基转移酶分选接收器，这样，控制这些酶的状态的稳定，防止超越高尔基体运输的分布。这个模式的额外支持来自最近的一项研究表明，对Vps74p的糖基转移酶保留规定另据报道（28）。虽然Vps74p，GPP34和GPP34R人类同源制止vps74D细胞（图3G和图。S9的），植物和原生动物表型似乎缺乏同源蛋白ofVps74p。因此，多种机制（1-3）可能功能，以确保正确定位高尔基居民糖基转移酶在细胞中。 参考文献与注释 1. 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