无菌检查验证范例(中检所).doc

虎杖苷注射液无菌检查的方法验证1. 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司提供，批号20040305。2. 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；霉菌液体培养基，批号040302； 营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。3. 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证 4. 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。5. 菌液制备：取经34培养1824小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105107约为50100cfu/ml备用。取经24培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105约为50100cfu/ml备用。取经34培养1824小时的生孢梭菌硫已醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至107备用。取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至104约为50100cfu/ml备用。6. 供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，过滤。7. 活菌计数活菌计数结果见表1。表1 活菌计数（cfu/ml）104稀释105稀释107稀释试验次数121212金黄色葡萄球菌5660枯草芽孢杆菌7779白色念珠菌8670黑曲霉菌8076铜绿假单胞菌47508 方法验证直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37培养35d，逐日观察，结果见表1、2、3。表2 虎杖苷注射液无菌检查法验证（直接接种法） 菌株 次数 管数培养基硫乙醇酸盐 霉菌 1 2 3 4 5 (d） 1 2 3 4 5金黄色葡萄球菌112 - - - - - - - - - -21 2 - - - - - - - - - -31 2 - - - - - - - - - -白色念株菌1 1 2 - + + + + - + + + +212 - + + + + - + + + +312 - + + + + - + + + +枯草杆菌112 - - - - - - - - - -212 - - - - - - - - - -312 - - - - - - - - - -黑曲霉112 - + + + + - + + + +212 - + + + + - + + + +312 - + + + + - + + + +铜绿假单胞菌112 + + + + + + + + + +212 + + + + + + + + + +312 + + + + + + + + + +生孢梭菌112 + + + + + + + + + +212 + + + + + + + + + +312 + + + + + + + + + +表3 薄膜过滤法人工污染金黄色葡萄球菌（活菌数58cfu）硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器）实验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d1（冲洗量500 ml）+2（冲洗量500 ml）+阴性对照（50 ml）-表4 薄膜过滤法人工污染枯草杆菌（活菌数78cfu）硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器）实验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d1（冲洗量500 ml）+2（冲洗量500 ml）+阴性对照（50 ml）-9 结论：根据上述结果，由于