免疫血液自动化检测风险评估和确认研究.doc

实验室质量控制免疫血液自动化检测风险评估和确认研究免疫血液实验室检测已经从经典试管法的1.1 ABO血型方法学发展为应用各种技术和方法的自动化系统。自动化系统可提高免疫血液检测的效率，如缩短报告周转时间、结果解释的标准化等。但免疫血液检测自动化要求实验室在投入常规使用前对其进行风险评估和确认/验证活动。ABO血型测定是检测待检者血液红细胞上有无A和/或B抗原、和血浆或血清中有无抗A和/或抗B抗体，前者称为正定型，后者称为反定型。ABO血型检测的原理是缺乏某种特定抗原的个体，其血清内必定具有相应的抗体。这些抗体是天然产生的、可预期的抗体，称为ABO同种血凝素，由抗-A、抗-B和抗-A,B组成。未实现自动化之前，常规ABO定型试验常采用经典的试管离心法，无需孵育。表1展示了最常见的血型反应组合。当正定型和反定型结果不符合时，应暂停ABO血型检测的结果发放和解释，调查不符合的原因。首先，实验室必须明确自动化系统的性能要求。性能要求可来源于当地和/或国家法规要求，也可以是试验的临床用途确定。第二，实验室应选择厂家声明能满足规定性能要求的自动化系统。最后实验室需确认/验证自动化系统符合厂家声明。只有完成以上步骤，自动系统才可用于常规检测。表1 血液定型试验和预期反应正定型反定型ABO存在的抗原存在的抗体抗A抗BA细胞B细胞OA无A和B抗原A抗原抗-A、抗-B、抗-A,B抗-B抗-A无B抗原A和B抗原注：“-”为阴性反应，“”为阳性反应。一、免疫血液检测1.2 Rh血型1. 血型检测Rh血型鉴定是指用抗-D试剂检测红细胞上有无D抗原。D抗原是Rh血型系统中的一个成员，目前Rh系统包括46种抗原，其他的主要抗原有C、c、E、e。根据检测方法，D抗原检测可能也需要试剂对照，这种情况下，对照液应包含与抗-D血清相当的蛋白质，通常为试剂中除了抗-D以外的惰性成分，以检测红细胞的自发性凝集导致的假阳性结果。血型检测指测定待测血液中有无血型抗原，通常用抗血清检测特定红细胞抗原，通过红细胞与抗血清的特异性反应表明有或无相应抗原。例如，红细胞标本与抗A血清反应表示有A抗原，即A+。血型检测有多种方法，没有一种特定的抗血清或技术能保证检出所有罕见、微弱或变异的抗原，因此要谨慎选择最适合实验室特定要求和标准的试剂和方法。某些个体的D抗原表达减弱，其可能原因是是抗原位点的减少（弱D或Du抗原），也可能是细胞外D表位的缺失（部分D抗原）。采用直接凝集法，用抗-D试剂检测这些个体的红细胞时有可能出现假阴性结果。习惯上，弱D抗原指D抗原和抗D试剂在离心或37孵育后不产生直接凝集反应，而仅与抗人免疫球蛋白试剂产生凝集反应。弱D试验在受血者中的作用还不是那么肯定，但在供血者和D阴性母亲生的新生儿中弱D或部分D的检测是非常重要65 实验室质量控制的。这种新生儿需进行Rh免疫球蛋白预防溶血。同样没有一种单独的方法或试剂能通过直接凝集反应检出所有的D变异型，实验室应审查试剂说明书或用户手册，明确其能否适用本实验室要求的弱D试验。性，应进行直接抗球蛋白试验。实验室应自己确定用于明确抗体特异性的抗原阳性和抗原阴性的试剂红细胞数目和组合。自动化系统中，抗原抗体反应可能采用光学/数字分析。通过比较红细胞的反应模式和已建立的阈值，确定反应为阳性（+）、阴性（-）或不确定性（？）。然后将反应与程序化逻辑相比，得到检测结果的解释，如表2和表3所示。4. 交叉配血血清学交叉配血试验为受血者血浆和供血者红细胞之间的反应，是检出ABO不相容性及临床上有意义的抗体的过程。如果抗体筛查试验未检出抗体，且病人无特定抗体过去史，则选择合适的ABO和Rh血型的红细胞单位进行输血，可采用快速离心血清学交叉配血检测ABO不相容性。如果检测到个体有临床意义的抗体或者有同种抗体的过去史，应选择无相关抗原的红细胞进行输血。在这种情况下，血清学交叉配血方法必须能检出有临床意义的同种抗体引起的不相容。这些方法应包括37孵育阶段和抗人球蛋白试验。实验室有责任明确此试验的当地或国家法规要求。1.3 其他红细胞抗原其他红细胞抗原（表型）包括C（Rh2）、c（Rh4）、E（Rh3）、e（Rh5）、JKa（JK1）、K（KEL1）等，目前多通过自动化检测方法完成，后者适用于大量标本的筛查。需要标本特殊红细胞抗原鉴定试验的情况有：1）患者标本，以支持抗体鉴定；2）供血者，为同种免疫性疾病患者输血选择抗原阴性的红细胞单位。并非所有的自动化系统都能进行RBC特殊抗原鉴定，用户必须审查使用手册明确自动化系统的抗原检测的范围和能力。表2 ABO血型检测结果解释抗A抗B 抗A,B A1RRBC B RRBC 解释OA注：RRBC为试剂红细胞表3 抗体筛查检测结果解释RRBC-RRBC-解释阴性阳性阳性阳性2. 红细胞同种抗体检测红细胞同种抗体主要检测非ABO系统（如Kidd，Duffy或Kell系统中的抗原）的不规则同种抗体，通过O型试剂红细胞（或其他红细胞抗原表达的材料）与血浆或血清的结合进行检测。选择O型红细胞能避免ABO同种凝集素结合而产生的干扰。患者标本抗体检测时可能采用2-4种的试剂红细胞，对供血者标本抗体检测可选择2种试剂红细胞进行筛选。检测过程包括37孵育和抗人球蛋白反应阶段。没有一种单独的不规则红细胞抗体筛查方法能可靠地检出所有临床上有意义的不规则红细胞抗体。5. 直接抗球蛋白试验直接抗球蛋白试验（DAT）检测体内红细胞上是否结合IgG和/或C3。用抗人球蛋白试剂检测红细胞，观察是否有凝集。抗人球蛋白试剂分三种类型：多特异性（包括抗-IgG和抗-C3），抗-IgG和抗-C3。注：RRBC为试剂红细胞1. 溶血凝集反应溶血凝集反应的自动化系统通常采用微量板法，后者为带有U形或梯形底部的小孔。有梯形底部的盘能稳定反应图案，阻止变动或变形，以捕捉清晰的图像。自动化溶血凝集反应方法中，每个微量板的小孔代表一个测试管，与常规手工方法类似，试剂和样本加入微孔中发生反应。离心法直接重悬微孔底部的细胞判断是否有凝集。沉降法凝集反应（阳性反应）为出现均匀的细胞层，无凝集反应呈现（阴性反应）一个紧密点，周围清晰。如图1所示。二、自动化方法目前已建立多种体外检测红细胞抗原抗体反应的自动化系统。在未实现自动化之前，免疫血液检测都在试管中进行。自动化系统应用各种方法监测抗原抗体反应，包括溶血凝集反应和固相柱凝集反应等，出现凝集表示反应性或阳性结果。孵育步骤可提供足够的时间用于抗原抗体反应。抗原抗体反应检测完后，自动化系统记录终末点并解释测试结果。3. 红细胞抗体鉴定试验如果抗体检测试验阳性，应继续做抗体鉴定试验，明确特异性抗体。抗体鉴定试验指用一组10-16人已知抗原组成的O型红细胞组成的试剂红细胞（或采用一组红细胞抗原表达材料）检测血浆或血清。此外，可能还需进行自身对照，如果自身对照阳66 实验室质量控制3. 微柱凝集技术微柱凝集技术是红细胞抗原与相应抗体发生凝集反应，通过微柱介质进行检测的一种免疫学新技术，主要介质有凝胶或微玻璃珠。可用于血型检测、交叉配血、抗体筛查、抗体鉴定、直接/间接抗人球蛋白试验等检测。通常采用微柱卡或微柱条，能区分未凝集和凝集的红细胞介质。通常在每个柱顶部的反应腔中加入微量的红细胞/试剂红细胞和血浆/血清，然后孵育和离心。在离心过程中红细胞通过微柱，未凝集的红细胞无阻力地沉到底部，凝集红细胞被阻滞在微柱中或者柱的顶部。在某些检测方法中，微柱介质中加入特定的抗血清，以选择性地捕获通过介质过程中致敏的细胞。图1 沉降法结果解释2. 固相微量滴定板固相微量滴定技术是将反应某一成分固定于微孔表面，其以多种形式存在：1）使用已知抗原性材料检测标本中的抗体：一种方法是将已知的抗原性材料固定在微孔表面，如完整试剂红细胞、试剂红细胞膜、抗原本身，检测样品加入至微孔中，与微孔表面的抗原反应。再加入包被抗-IgG的指示试剂红细胞。如果抗体结合到微孔上，则指示试剂红细胞可吸附到微孔表面，呈现阳性反应。另一种方法是抗原抗体反应在液相中进行，阳性抗原抗体结合物能固定至包被有A蛋白的微孔表面。在微孔中加入试剂红细胞、未知血清或血浆及低离子强度溶液，随后加入抗-IgG，结合在试剂红细胞上的抗体与蛋白A形成网格结构，出现均匀的试剂红细胞层，即阳性反应。图3为微柱凝集技术结果解释，反应性等级或得分与试管法反应的模式类似。未凝集或未结合的红细胞沉降至底部形成一圆点，为阴性反应，凝集或致敏的红细胞在微柱顶部或中间被捕获，为阳性反应。2）使用已知特异性的抗体检测红细胞上表达的抗原：一种方法是用抗-红细胞抗体把样品红细胞固定在微孔表面。加入已知特异性的抗体与样品红细胞发生反应，再加入抗-IgG包被的红细胞作为指示剂检测吸附的抗体。如果抗体结合到微孔上，那么指示红细胞也结合到微孔表面，即呈现阳性反应。另一种方法是把样品红细胞和已知特异性的IgG抗体加入到蛋白A包被的微孔中并孵育，然后加入抗-IgG。抗体吸附到红细胞上并与蛋白A形成网格结构，出现均匀的红细胞层，即呈现阳性反应。3）检测IgG体内包被的红细胞一种方法是样品红细胞加入到抗-红细胞抗体包被的微孔形成单细胞层，然后加入抗-IgG包被的指示红细胞。图3 微柱凝集结果解释另一种方法是样品红细胞加入到蛋白A包被的微孔中。图2为结果解释示意图，如果红细胞与微孔表面上固化的材料结合，表示反应阳性，相反如果离心后红细胞沉于微孔底部，表示无抗原抗体反应，结果为阴性。三、自动化免疫血液系统的确认/验证自动化免疫血液系统在投入常规应用前应执行确认/验证活动，具体内容至少包括图4的各个步骤。确认/验证过程中的每个任务和相关活动都应有相应的文件记录。如果任务中出现不符合的情况，应该记录下来并进行调查，明确原因及后果。每个不符合的情况解决后才能执行下一个任务。图2 微量板法结果解释67 实验室质量控制下文提供了部分模板表格供实验室参考。潜在失效模式及合理的控制点来预防或检测故障，如图5所示。此外实验室还可以回顾厂家提供的信息，包括预期用途（局限性、警告、预防），性能特征，校准、保养、使用及试剂储存要求，校准溯源性信息，厂家风险评估的剩余风险等。但是评价这些信息的有效性时应考虑厂家采用的试验条件是否满足要求，研究结果是否足以证明其适用性。例如，厂家的模拟条件不能完全复制偶然差错，研究结果应以可信区间的形式进行报告，但可能厂家未提供，如厂家试验中包含20个标本，研究结果表明当检测结果超出真值的15%时，系统能正确识别90%的错误结果，因此得出90%误差检出率是不正确的。因为此研究仅检测20个标本，真实的误差检出率应为69.9-97.2%，即90%的95%可信区间。实验室信息和临床信息是风险评估的关键信息来源，前者包括环境条件（设备、用途及现有的控制）、安装/运行验证报告、操作者培训和技能、内部性能评估数据、外部性能数据等，后者包括试验结果的临床应用、生物参考区间、不正确或延迟结果的预期后果、患者危害严重度等。图4 自动化系统的确认/验证四、自动化免疫血液系统风险评估风险评估有助于实验室识别自动化系统中存在的薄弱点及关键控制点，可能对患者、献血者、实验室人员造成的危害。风险评估过程包括：危险因素识别、风险估计、风险评价、风险控制等。图5 实验室检测过程流程图1. 危险因素识别风险分析的第一步是识别潜在危险因素及其原因。实验室可绘制详细完整的检测过程流程图，将整个测量系统分成若干步骤，以采集有用的信息，识别检测过程的2. 风险估计风险估计包括危害发生概率和危害严重度的估计。68 实验室质量控制2.1危害发生概率受水平时，其风险也是可接受的。实验室应明确采取控制措施后的剩余风险是否是临床可接受的。如前危害发生概率和严重度的估计为描述性，风险可接受性矩阵表用于评价风险是否可接受是一种可行的方法，如表4所示。识别潜在失效模式后需要估计危害发生的可能性。免疫血液学检测对患者造成的危害无非来源于不正确的结果和延迟的结果，评价其可能性时应完全理解实验室质量管理系统及检测结果的临床应用方式。注意危害发生概率估计时有可能会高于真实情况，因为不是每个失效模式都会导致最终的患者危害，如图6所示，每个失效模式都以一定的概率导致下游事件的发生，即危害发生的概率应为所有系列事件发生概率的乘积。但是各个下游事件发生概率的定量估计不易，通常采用描述性半定量方法来估计危害发生概率，如如ISO14971的半定量分级：经常=每周1次；可能=每月1次；偶尔=每年1次；很少=几年1次；不可能=整个使用期间1次。以下信息来源可能有助于实验室或风险评估小组估计错误或延迟报告的发生概率：历史故障数据、方法学评估数据、质控或能力验证信息、发表的文献、不良事件报告等。同时可寻求相关专家协助估计判定，专家组最好包括检测过程、测量系统和临床应用的各方专家。表4 风险可接受性矩形表危害严重度危害概率可忽略很小严重重要 灾难性经常可能不接受 不接受 不接受 不接受 不接受接受接受接受接受不接受 不接受 不接受 不接受偶尔接受接受接受接受 不接受 不接受稀有接受接受接受 不接受不可能接受接受4. 风险控制如果风险评估结果不可接受，则需要对相应的失效模式采取控制措施，使剩余风险降低至可接受水平。实验室应评估每种风险控制措施，如厂家提供的具体缓解措施或质控工具，并验证其该措施能使故障降低至临床可接受水平。如果剩余风险是临床不可接受的，实验室还需采取其他措施来降低风险，重复此过程直至剩余风险降低至可行的、可接受的水平。图6 产生患者危害的序列事件2.2 危害的严重度故障危害包括不正确结果、延迟结果和无结果。例如，错误结果导致误诊，继而患者无法接受正确及时的诊疗活动，造成患者危害。故障的评估重点是危害的严重度，这需要实验室和临床共同协商判断。需要考虑的关键因素包括：1）临床医生会如何使用该结果？2）确认检测结果的其他相关信息？3）临床医生在处理结果前获得确证结果的概率？4) 结果引起临床决策有多快？不同的质控措施或质控工具都有一定的优缺点，没有一个单独的质控工具能持续预防或检出所有故障，理解其优缺点能使这些工具能有效地降低风险至可接受水平。常用的质控措施有质控品的分析，包括室内质量控制、室间质量评价、正确度验证计划等；内置测量系统的控制，如一体化质控品，即整合于测量系统中的配套质控品；患者结果的质控方法，包括患者标本重复检测、总体患者结果监测、不可信值、差值检验等。5）根据结果会对患者采取哪些干扰措施？6）不正确的干扰会对患者产生什么危害？7）危害有多严重？ISO14971也列出关于危害严重度的半定量分级：可忽略=临时不适；很小=临时伤害，不需要专业的医学干扰；严重=需要专业的医学干扰的伤害；危急=永久的或危及生命的伤害；灾难性=引起患者死亡。3. 风险评价危害发生概率和严重度估计后，可与既定的可接受风险进行比较，以评估风险的可接受性。评估时应考虑试验的临床用途和及现阶段实验室检测能能达到的技术水平，完全阻止故障或者检出所有不正确结果只是理想状态。如果能将不正确结果的发生概率降低至可接如果控制措施能使剩余风险降低至可接受69 实验室质量控制水平，则可将其纳入实验室质量控制计划中，并定期验证其长期有效性。五、确认/验证过程的表格参考自动化免疫血液分析仪使用前的确认主要包括安装确认/验证、运行确认/验证、性能确认/验证等，具体方案可参考文献2。表58分别为安装确认/验证、运行确认/验证、性能确认/验证的实例供实验室参考使用，特定实验室环境可作相应的调整。当然，自动化系统的确认/验证过程还包括很多步骤，实验室可自行作出类似的表格。表912为ABO/Rh血型方法比对试验，包括比对结果、一致率、不符合率及原因调查和处理实例。表5 安装确认：分配用户权限目的为满足安装确认要求，验证“XXX检测系统”的用户权限符合实验室要求1）为所有用户建立密码保护功能的分配细节2）检测系统或实验室特定要求先决条件如有以下证明文件，则视为通过：1）界定密码保护功能通过/失败标准参考2）界定用户3）界定密码保护功能的用户权限优先权4）界定密码控制类型执行该过程时参考“XXX检测系统”用户手册“XXX章节”1）按实验室要求增加新用户名2）按实验室要求建立密码保护软件功能3）按实验室要求为每个用户设置密码保护功能优先权4）按实验室要求明确密码控制类型设置5）按实验室要求记录和保存各个输入程序通过执行员：审核员：未通过不符合报告，见“XXX文件”结果可接受性日期：日期：表6 运行确认：手工输入试剂信息目的为满足运行确认要求，验证“XXX检测系统”的手工试剂信息录入的可行性检测系统或实验室特定要求先决条件如有以下证明文件，则视为通过：通过/失败标准试剂信息可成功地手工输入“XXX检测系统”中，且可进行查看审核。执行该过程时参考“XXX检测系统”用户手册“XXX章节”参考程序1）确认需要检测的标本2）自动化检测系统的特定程序通过执行员：审核员：未通过不符合报告，见“XX文件”结果可接受性日期：日期：70 实验室质量控制表7 运行确认：自动录入标本ID目的为满足运行确认要求，验证“XXX检测系统”按照实验室特定标准，自动录入标本ID和试管直径1）至少3个带条形码的标本2）决定测定试管直径的方法：“XXX检测系统”自动测定试管直径并输入数据库、用户输入试管直径3）确认同一标本的不同试管直径可用于“XXX检测系统”4）检测系统或实验室特定要求先决条件如有以下证明文件，则视为通过：1）标本ID自动录入至“XXX检测系统”通过/失败标准参考2）持续识别标本ID，直到检出两个空位3）持续识别下一系列的标本ID，直到检出下两个空位4）试管直径成功录入至“XXX检测系统”数据库中：自动录入正确的试管直径；手工录入时选择直径的适当性执行该过程时参考“XXX检测系统”用户手册“XXX章节”自动化检测系统的特定程序，如：1）如采用操作者输入试管直径，记录选择的直径2）将带条形码的标本试管置于自动化系统的位置1、4和53）确认位置1的标本被正确识别程序4）确认位置4和5的标本被正确识别5）如系统自动测定试管直径，验证“XXX检测系统”中试管直径数据库的正确性；如操作者手工录入直径，验证数据与步骤1）中的一致性。通过执行员：审核员：未通过不符合报告，见“XX文件”结果可接受性日期：日期：表8 性能确认：常规程序目的为满足性能确认要求，验证“XXX检测系统”按照实验室特定标准执行常规操作过程标本试管满足要求，如：1）使用单管和/或双管至少3个带条形码的标本2）使用献血者标本进行交叉配血3）检测系统或实验室特定要求先决条件如有以下证明文件，则视为通过：通过/失败标准参考1）“XXX检测系统”满足实验室常规操作过程的要求2）所有的检测是正确和完整的执行该过程时参考“XXX检测系统”用户手册“XXX章节”自动化检测系统的特定程序，如：1）核对检测配置，用“Y/N”表明是否纳入SOPY/N单管，一个检测，无交叉配血双管，一个检测，无交叉配血受者双管/供者单管受者双管/供者双管受者单管/供者单管受者单管/供者双管程序2）将试管置于检测配置中要求的位置3）按照SOP制定检测，添加合适的试剂、稀释液和介质4）按照SOP启动程序5）观察自动化系统的终端-终端程序的运行性能，与实验室要求和预期结果进行比较。确保自动化系统运行性能满足实验室要求。6）验证检测成功完成7）打印常规程序需要的报告8）如有需要，对所有试验执行确认活动通过执行员：审核员：未通过不符合报告，见“XX文件”结果可接受性日期：日期：71 实验室质量控制表9 自动化系统和方法比对结果工作表测试个案号：比较方法：操作者：标本ID操作日期：比较方法结果“XXX检测系统”结果判断：TP, TN, FP, FN审核者：审核结论：审核日期：注：真阳性（TP）：比较方法检出的阳性结果中自动化系统检测仍为阳性结果真阴性（TN）：比较方法检出的阴性结果中自动化系统检测仍为阴性结果假阳性（FP）：比较方法检出的阴性结果中自动化系统检测为阳性结果假阴性（FN）：比较方法检出的阳性结果中自动化系统检测为阴性结果表10 一致性计算表格（ABO/Rh血型）测试个案号比较方法操作者：操作日期：检测标本总数：无定型分析“XXX检测系统”比较方法标本检测总数（TOL）标本检测总数（TOL）无结果或未鉴定血型的标本数无结果或未鉴定血型的标本数（NTD）未定型率（NTD/TOL）*100%（NTD）未定型率（NTD/TOL）*100%一致性分析标本检测总数（TOL）两种方法检结果一致标本数（CON）一致率（