心脏干细胞分离培养及其增殖与迁移的机制.doc

www.CRTER.org侯波，等. 心脏干细胞分离培养及其增殖与迁移的机制心脏干细胞分离培养及其增殖与迁移的机制侯 波1，朱先云2，王学坤3(青岛市胶州中心医院，1心内科，2内分泌科，山东省青岛市 266300；3青岛市中心医院心内科，山东省青岛市 266042)引用本文：侯波，朱先云，王学坤. 心脏干细胞分离培养及其增殖与迁移的机制J.中国组织工程研究，2016，20(41):6190-6196.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.017 ORCID: 0000-0002-7743-0450(侯波)文章快速阅读：心脏干细胞的分离培养及检测侯波，男，汉族，1969年生，山东省胶州市人，1992年潍坊医学院毕业，副主任医师。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)41-06190-07稿件接受：2016-09-07苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫荧光染色大鼠心脏干细胞分离、培养免疫荧光检测相关分子标志物 文题释义：干细胞niche：在心脏干细胞的自我更新、生长增殖、多向分化和持续存活等方面需要依赖特定的微环境，即干细胞niche。干细胞niche对干细胞的作用是通过多种因素起作用的，例如干细胞间的相互作用、干细胞与邻近分化细胞的相互作用、干细胞与细胞因子、生长因子及黏附因子的相互作用等，干细胞niche调控干细胞自我更新、多向分化是一个复杂的网络。心肌重构：是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化，这些变化包括心肌细胞肥大、细胞凋亡、胚胎基因和蛋白质的再表达、心肌细胞外基质量和组成的变化。摘要背景：体外环境下进行心脏干细胞培养的过程中，生长微环境可能会对细胞的的增殖等产生一定的影响。目的：在体外环境下培养大鼠心脏干细胞，探讨心脏干细胞增殖、迁移的可能机制。方法：纳入SD大鼠10只，获得心肌组织块进行原代和传代培养。收集第3代心脏干细胞进行免疫荧光染色，进行干细胞鉴定，检测干细胞生长因子受体(c-kit)和CD45、CD90的表达。收集培养后的组织块，随机分为2 份，一份用多聚甲醛进行固定，常规石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红染色、Masson染色以及细胞凋亡检测；另一份在培养基中添加EdU标记增殖细胞，采用免疫荧光染色检测c-kit阳性细胞以及基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1等表达。 结果与结论：细胞鉴定结果：心肌组织培养7-10 d后有明亮的圆形细胞长出，细胞贴壁后呈梭状，生长、增殖能力旺盛。免疫荧光染色可观察到大量细胞呈c-kit、CD45阳性表达，CD90阴性表达；细胞凋亡情况：培养的组织块切片后染色见大量新生细胞生长的同时伴随心肌细胞的凋亡；免疫荧光染色结果：经EdU标记后阳性细胞分布于心肌间隙，基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1少量表达，但周围心肌组织上述3因子表达明显增多。结果表明，心肌组织体外培养可获取心脏干细胞，伴随细胞增殖和迁移，其机制与基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1的表达有关。关键词：干细胞；培养；心脏干细胞；心脏；细胞稳态；微环境；作用机制主题词：组织工程；干细胞；细胞增殖6191 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Cardiac stem cells: isolation, culture, proliferation and migrationHou Bo1, Zhu Xian-yun2, Wang Xue-kun3 (1Department of Cardiology, 2Department of Endocrinology, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, Qingdao 266300, Shandong Province, China; 3Department of Cardiology, Qingdao Central Hospital, Qingdao 266042, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: In the process of cardiac stem cell culture in vitro, the growth microenvironment may have some effects on the cell proliferation.OBJECTIVE: To investigate the possible mechanism of proliferation and migration of rat cardiac stem cells cultured in vitro.METHODS: Cardiac tissues from 10 Sprague-Dawley rats were obtained for primary culture and subculture. Passage 3 cells were collected for immunofluorescence staining, and stem cell growth factor receptor (c-kit) and CD45, CD90 were detected. Cultured tissues were collected and randomly divided into two groups: in group 1, paraformaldehyde fixation, paraffin embedding, hematoxylin-eosin staining, Masson staining, and detecting apoptotic cells using TUNEL method were conducted; in group 2, EdU labeling of proliferated cells, immunofluorescent detection of c-kit positive expression, matrix metalloproteinases 2, 9 and transforming growth factor 1 using immunofluorescent staining were done.RESULTS AND CONCLUSION: After 7-10 days of myocardial tissue culture, bright and round cells were visible, and after adhesion, fusiform cells exhibited strong growth and proliferation ability. Immunofluorescence staining showed a large number of c-kit, CD45 positive cells but CD90 negative cells. After culture, a great number of newborn cells were found, accompanied by apoptosis of myocardial cells. After EdU staining, the positive cells were distributed in the myocardial gap, and showed a small amount of matrix metalloproteinases 2, 9 and transforming growth factor 1, while in the surrounding myocardium there was a large number of matrix metalloproteinases 2, 9 and transforming growth factor 1. Taken together, our findings show that cardiac stem cells could be obtained through myocardial tissue culture in vitro, accompanied by cell proliferation and migration. The mechanism is related to the expression of matrix metalloproteinases 2, 9 and transforming growth factor 1.Cite this article: Hou B, Zhu XY, Wang XK. Cardiac stem cells: isolation, culture, proliferation and migration. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(41):6190-6196.Hou Bo, Associate chief physician, Department of Cardiology, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, Qingdao 266300, Shandong Province, China6193ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction心肌梗死的发病率日益增加，但目前标准疗法的效果不尽如人意，因此，人们不断探索新的治疗手段。近年来，干细胞被认为是再生和修复心肌的重要来源之一，已有多种类型的干细胞被证明具有向心肌分化的能力1。目前，利用心脏干细胞分化出心肌细胞从而治疗心脏相关疾病，能够修复受损心肌组织，在短期心功能改善方面效果显著，使得心脏干细胞迅速进入到人类心肌梗死临床试验阶段，成为研究领域的一大热点2-3。干细胞移植后可以在梗死心肌内存活并分化为心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，分泌血管生长因子，从而促进血管新生和局部微血管的增生，减少心肌细胞凋亡，改善心肌重构，促进心脏功能的恢复4-5。在心脏干细胞的自我更新、生长增殖、多向分化和持续存活等方面需要依赖特定的微环境，即干细胞niche。干细胞niche对干细胞的作用是通过多种因素起作用的，例如干细胞间的相互作用、干细胞与邻近分化细胞的相互作用、干细胞与细胞因子、生长因子、黏附因子的相互作用等，干细胞niche调控干细胞自我更新、多向分化是一个复杂的网络6-8。但是，关于干细胞niche对心脏干细胞生长和增殖等的影响与具体的调控机制，以及对其稳态的影响等，还缺乏明确的定论，相关的报道较少，还需要更多的研究。为此，实验在体外环境下培养大鼠心脏干细胞，探讨心脏干细胞增殖、迁移的可能机制，为动员自身心脏干细胞治疗心脏疾病提供一定的参考依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞学体外实验。1.2 时间及地点 于2014年12月至2015年6月在潍坊医学院实验室完成。1.3 材料 健康雄性新生SD大鼠10只。研究相关方案均提交潍坊医学院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。1.4 实验方法1.4.1 心脏干细胞分离及培养9-11 将10只大鼠麻醉后处死，无菌环境下获得完整心脏组织置于培养皿中，用显微剪剪成1.0-2.0 mm3的小块状心肌组织，用DPBS冲洗心肌组织碎块至液体澄清，然后添加体积分数0.2%胰蛋白酶(上海弘顺生物科技有限公司)与0.1%胶原酶(上海信帆生物科技有限公司)混合液，于37 振荡消化30 min，连续机械吹打30 s，置于37 体积分数5%CO2培养箱中进行培养5 min，然后添加等体积DMEM完全培养液(上海甄准生物科技有限公司)，再次机械吹打后静置，过滤后利用适时培养液CEM(含体积分数为20%胎牛血清(海岚派生物科技有限公司)、 2 mmol/L L-谷氨酰胺(上海显益化学科技有限公司)、100 U/mL青霉素/链霉素双抗(上海恒斐生物科技有限公司，江苏凯基生物技术股份有限公司)、0.1 mmol/L -巯基乙醇(美国PeproTech公司)、的IMDM培养基进行洗涤，洗涤结束将组织块转移至培养皿中并使其分布均匀，添加上述培养基0.5-1.0 mL，置于37 体积分数5%CO2培养箱(上海雅吉生物科技有限公司)中连续培养4-6 h，轻轻摇晃培养皿，若组织块牢固贴敷在底部，则添加5 mL培养液继续进行培养，培养三四天进行1次半量换液，倒置显微镜(上海万疆生物技术有限公司)下观察细胞生长情况，当细胞增殖铺满培养瓶底90%左右即可进行传代。吸取并弃去培养瓶中培养液，用PBS洗2次，体积分数0.2%胰蛋白酶+0.02%EDTA适度消化两三分钟，镜下观察到细胞缩小变圆时终止消化，离心弃上清，加入适量完全移植物培养液CGM(含体积分数35%IMDM培养基，65%DMEM/F12培养基，3.5%胎牛血清，2%B27，质量浓度10 g/L表皮生长因子，20 g/L碱性成纤维细胞生长因子，4 g/L Cardiotrophin-1， 1 U/mL thrombin，100 U/mL青霉素/链霉素双抗， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L -巯基乙醇)，置于37 体积分数5%CO2培养箱中培养，每3 d进行1次半量换液，细胞大致铺满瓶底时按12比例继续传代培养，收集第3代细胞用于后续实验。1.4.2 免疫荧光检测相关分子标志物的表达 收集第3代心脏干细胞进行免疫荧光染色，检测干细胞生长因子受体(c-kit)和CD45、CD90等蛋白的表达12-15。细胞消化收集后计数细胞量，并分装到EP管中，添加冷却的M-Buffer定容，室温下离心去上清，冷M-Buffer 重悬，按照试剂盒说明书 加入各流式抗体(c-kit，CD45，CD90)，不加抗体设为空白对照组，4 孵育，荧光抗体或一抗孵育60 min，二抗孵育30 min，PBS 漂洗3次，离心，弃上清，用100 L 冷M-buffer重悬，避光送检。1.4.3 组织学观察 收集CEM培养液培养后的组织块，随机分为2份，一份利用40 g/L多聚甲醛(厦门慧嘉生物科技有限公司)进行固定，常规石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红染色及Masson染色，光学显微镜下观察心肌组织的形态学变化16-19，并严格按照试剂盒说明书，利用TUNEL试剂盒(北京旷博生物技术股份有限公司)检测进细胞凋亡情况。取另一份在CEM培养基中添加EdU(北京博蕾德科技发展有限公司)进行培养3 d，取出培养后的组织块用40 g/L多聚甲醛进行固定，蔗糖溶液梯度脱水后制备冰冻切片，进行免疫荧光染色，检测c-kit阳性细胞的生长情况以及基质金属蛋白酶2，9、转化生长因子1等表达。切片移到载玻片上，温箱中24 h，烘干后置于切片架上，65 烘箱中烤片30 min。分别与二甲苯和中脱蜡各15 min，梯度乙醇处理，PBS冲洗3次，每次5 min。高压修复，滴加山羊血清，取出切片PBS冲洗3次。一抗基质金属蛋白酶2，9、转化生长因子1均用 PBS以150稀释，滴加一抗放入湿盒，4 冰箱过夜，取出切片PBS冲洗3次。添加荧光二抗，室温条件下孵育，取出切片，滴加 DAPI复染核，激光共聚焦扫描显微镜下观察拍照。同时取未用胰酶、胶原酶消化的心肌块，直接培养4周后石蜡包埋切片机(上海玉博生物科技有限公司) 切片，进行Masson染色。1.5 主要观察指标 观察大鼠心脏组织免疫荧光染色结果与细胞凋亡TUNEL检测结果，以及心肌组织苏木 精-伊红染色与心肌组织Masson染色结果。2 结果 Results 2.1 大鼠心脏干细胞培养观察结果 培养3 d，组织块呈现出完全铺展生长状态，组织块中爬出少量的类纤维细胞(图1A)。传代培养5 d后，可以观察到细胞重新聚集成团(图1B)。2.2 心脏组织免疫荧光染色结果 经免疫荧光染色，正常心肌组织中可观察到少量c-kit阳性细胞(图2A)，心肌组织培养后1 d进行免疫荧光染色，可观察到大量c-kit阳性细胞，细胞呈簇状生长，胞浆丰富，细胞核较大。经EdU标记后可见阳性细胞分布于心肌间隙，呈基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1少量表达，周围心肌组织则存在基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1大量表达(图2B-E)。2.3 细胞凋亡TUNEL检测结果 经细胞凋亡检测，培养1 d之后的心肌组织内可观察到凋亡细胞与未凋亡细胞。凋亡细胞细胞核呈棕黄色，未凋亡细胞细胞核呈蓝色(图3)。 B A12图3 TUNEL检测细胞凋亡结果(200)Figure 3 TUNEL detection of cell apoptosis (200)图注：箭头1为凋亡细胞细胞核呈棕黄色，箭头2 为未凋亡细胞细胞核呈蓝色。图1 心脏干细胞培养观察结果(200)Figure 1 Observation of cardiac stem cells cultured (200)图注：图A为连续培养3 d，组织块中爬出少量的类纤维细胞；B为传代培养5 d后，可以观察到细胞重新聚集成团。图2 心脏组织免疫荧光染色结果(400)Figure 2 Immunofluorescence staining of the myocardial tissue (400)图注：图中A为经免疫荧光染色，正常心肌组织中可观察到少量c-kil阳性细胞(图中箭头)；图中B-E为心肌组织培养后进行免疫荧光染色，可观察到大量c-kit阳性细胞，细胞呈簇状生长，胞浆丰富，细胞核较大(图中箭头)。经EdU标记，阳性细胞分布于心肌间隙，周围心肌组织基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1大量表达(图中箭头)。 C B A A B图4 心肌组织苏木精-伊红染色结果(400)Figure 4 Hematoxylin-eosin staining of the myocardial tissue (400)图注：图A为正常心肌组织中，细胞呈有序排列；B为培养 后，心肌组织内可观察到存在大量新生细胞，新生细胞呈无序排列。图5 心肌组织Masson染色结果(400)Figure 5 Masson staining of the myocardial tissue (400)图注：图中A为经Masson染色正常心肌组织中可观察到心肌细胞间隙、心外膜、血管壁分布有胶原纤维；B为培养后，心肌组织内胶原纤维呈现出紊乱排列现象，组织间隙中可观察到大量核大而圆的细胞；C为心肌组织块周围存在纤维组织大量增生现象，新生细胞较少。2.4 心肌组织苏木精-伊红染色结果 对心肌组织标本进行苏木精-伊红染色和观察，可以发现，正常心肌组织中，细胞呈有序排列(图4A)。培养3 d后，心肌组织内可观察到存在大量新生细胞，新生细胞呈无序排列(图4B)。2.5 心肌组织Masson染色结果 经Masson染色后，正常心肌相组织中可观察到心肌细胞间隙、心外膜、血管壁分布有胶原纤维(图5A)。经过1 d培养后，组织内胶原纤维呈现出紊乱排列现象，组织间隙中可观察到大量核大而圆的细胞(图5B)。组织块周围存在纤维组织大量增生现象，新生细胞较少(图5C)。3 讨论 Discussion在干细胞的生长和增殖过程中需要一定的环境条件，这一环境即为小生境(niche)20。在相应的微环境中，包含干细胞相邻的不同细胞类型和细胞外基质以及大量的细胞因子等21。心脏干细胞是一种重要的干细胞类型，其生存和增殖等也需要依靠一定的环境条件，并存在于其赖以生存的niche22-23。2004年，Messina等24通过对心肌活检组织进行直接培养，获得一类特殊的干细胞团。该细胞团呈球状聚集生长，并在体内呈现出很强的多向分化潜能。研究中，学者们通过将其移植到心肌梗死小鼠模型体内并进行观察发现，该细胞团可以发挥出有效的改善心肌梗死动物心功能的作用，并将其命名为“Cardiospheres”。“Cardiospheres”来源的心脏干细胞获取方法简单，并简化了分离程序25。此次实验利用上述方法获得了心脏干细胞。EdU属于胸腺嘧啶核苷类似物，在不同细胞增殖的过程中，通过EdU标记，可以将其插入正在复制的DNA分子中，进而对处于S期的增殖细胞情况进行检测26-29。基质金属蛋白酶2，9、转化生长因子1均属于重要的活性分子，会参与到心脏重构过程之中。心肌重构是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化，这些变化包括心肌细胞肥大、细胞凋亡、胚胎基因和蛋白质的再表达、心肌细胞外基质量和组成的变化。转化生长因子1具有促进细胞分化、迁移、黏附、调控基质蛋白合成及早期胚胎发生的功能。转化生长因子1对心肌发育具有重要作用。细胞外基质参与和促进了心肌重塑的过程,基质金属蛋白酶是调节细胞外基质重要的酶。基质金属蛋白酶2，9、转化生长因子1可以对细胞外基质予以降解，诱导心肌细胞的凋亡30-31。实验中，经EdU染色，阳性细胞分布于心肌间隙，呈基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1少量表达，周围心肌组织则存在基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1大量表达。上述结果表明，培养之后的细胞处于增殖期，且心脏干细胞可以参与到心室重构之中，发挥出一定的修复效果32-37。实验中，经细胞凋亡检测发现，培养之后的心肌组织内可观察到凋亡细胞与未凋亡细胞，即提示，在新生细胞发生大量增殖的同时，会出现心肌细胞大量凋亡的情况。试验中，对心肌组织标本进行苏木精-伊红染色和观察，培养之后心肌组织内可观察到存在大量新生细胞，新生细胞呈无序排列。经Masson染色，经过培养过之后，组织内胶原纤维呈现出紊乱排列现象，组织间隙中可观察到大量核大而圆的细胞。Masson染色可观察到组织块周围存在纤维组织大量增生现象，新生细胞较少。由此也可以推测，心肌组织基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1表达水平偏高可能与细胞外基质降解及细胞凋亡之间存在一定的关系，心脏干细胞自身很少合成能降解细胞外基质纤维成分的基质金属蛋白酶类，此结果有助于对心室重构过程中心脏干细胞修复功能“缺失”的现象予以解释。但临床治疗过程中，抑制心室重构能否促进心脏干细胞的增殖与归巢，相关机制还不清楚，还需要予以进一步的研究。上述结果表明，cardiospheres可能是由一群多能干细胞及相关细胞构成的，可以形成一定的微环境(niche)38-55。这一环境会对心脏干细胞产生一定的影响，有效促进其生长和增殖等。综上所述，通过实验发现，心肌组织体外培养可获取心脏干细胞，伴随细胞增殖和迁移，其机制与基质金属蛋白酶2，9及转化生长因子1的表达有关。相应的干细胞niche可以为细胞的生长和增殖等提供所需的微环境，以维持心脏干细胞稳态。作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者。实验实施为第一、二、三作者。实验评估为第二作者和通讯作者。资料收集为第一、二作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合 2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 张文波,刘云奇,唐白云,等.Telocyte细胞参与体外培养成体心脏干细胞巢的构建J.中华实验外科杂志,2015, 32(8):1831-1832.2 刘云奇,杨嵩,张希,等.心脏干细胞生长微环境及其体外生物学特性J.中华胸心血管外科杂志,2012,28(6):368-372.3 Lemieux C, Cloutier I, Tanguay JF, et al. 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