WB的转膜和染色.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请 联系网站删除WB的转膜和染色凝胶中蛋白的可视化在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察SDS-PAGE结果。考马斯染色切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用40%蒸馏水、10%醋酸、50%甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比0.25%的考马斯亮蓝R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育4小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到67.5%蒸馏水、7.5%醋酸、25%甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。铜染色法用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多30分钟），然后转移至0.3 M CuCl2溶液染色515分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用0.10.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。转膜转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是1xTris-甘氨酸缓冲液，但是没有SDS，并加入了甲醇至终浓度20%。对于分子量大于100 kDa的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为0.1%的SDS。在半干法转膜中，三明治由滤纸凝胶膜滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。半干转的转膜缓冲液中Tris和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是48 mM Tris、39 mM甘氨酸、0.04% SDS、20%甲醇。有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡12分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育5分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。小分子和大分子蛋白的转膜转膜缓冲液中SDS和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：大分子蛋白(100 kD)对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。 大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。 降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。 只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。 选择湿转 4C 过夜，不建议选择半干转。小分子蛋白(100 kD)SDS 妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加 SDS。保持甲醇的浓度20%。对于500 kD 的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem, 247, 18592.更多转膜提示： 使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。 将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者 15 mL 管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。 确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。 鸡来源的抗体会结合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以帮助降低背景染色。丽春红染色使膜上蛋白可视化要确定转膜的成功，用TBST洗膜。将丽春红母液按照1:100稀释。母液是2%的丽春红S加入30%的三氯乙酸和30%的磺基水杨酸制成。在丽春红染色液中孵育5分钟，然后用大量水冲洗直至水清澈、蛋白条带显现。该膜可以用TBST或水重复冲洗至完全脱色。对于PVDF膜，用甲醇重新激活后，再用TBST清洗。TBS 10x1 L溶液；24.23 g TrizmaHCl80.06 g NaCl在800mL蒸馏水中溶解用HCl将pH调至7.6将体积加至1 LTBST1 L溶液；100 mLTBS 10x900 mL蒸馏水1 mLTween 20Tween 20很粘稠，会粘在枪头上。请确保在Tris缓冲液中加入正确的剂量。使用10%的溶液比直接加入未稀释的Tween 20更容易操作。膜的封闭封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。通常使用两种封闭溶液：脱脂牛奶或BSA (Cohn fraction V)。牛奶相对便宜，但是不推荐用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，可能会导致抗体的非特异性结合，形成高背景。有些抗体对BSA封闭的膜比牛奶封闭的膜信号更强，原因还不清楚。查看数据表中的应用说明，看其中是否有封闭的具体说明。配置5%的牛奶或BSA溶液，即在每100 mLTBS含Tween 20(TBST)的缓冲液中加入5 g牛奶或BSA。充分混合并过滤。不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。在摇床上4C孵育1小时。孵育后用TBST冲洗5秒。一抗孵育孵育缓冲液以建议稀释度在TBST中稀释抗体。如果数据表没有标明建议稀释度，设计稀释梯度(1:1001:3000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异性条带。某些实验室习惯使用封闭缓冲液，而另一些实验室则使用不含封闭剂的TBST来孵育抗体。您可能会发现抗体缓冲液加或不加封闭剂，不同的抗体，结果也不尽相同，。如果没有高背景问题，用低浓度(0.50.25%)甚至完全不加牛奶或BSA，有些抗体会产生更强的信号。孵育时间时间可能从几小时到过夜不等（不超过18小时），取决于抗体对蛋白的亲和力和蛋白丰度。我们建议抗体更高的稀释度、更长的孵育时间，确保特异性结合。孵育温度最好低温孵育。如果在封闭缓冲液中孵育过夜，必须在4C孵育，否则会出现污染从而破坏蛋白（尤其是磷酸化基团）。建议在摇床上孵育，充分均匀覆盖膜，防止结合的不均匀。二抗孵育用TBST清洗膜数次，每次清洗5分钟或更长，去除残余一抗。孵育缓冲液与稀释度以建议的稀释度在TBST中稀释抗体。如果数据表没有推荐的稀释度，设计稀释梯度(1:1,0001:2,0000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异条带。您可以在封闭缓冲液中孵育二抗，但是在降低背景时可能会牺牲特异性信号的强度，这可能是因为封闭蛋白会阻碍抗体目标蛋白的结合。孵育时间和温度摇床上室温孵育12小时。选择哪个偶联物？我们推荐辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗，不推荐碱性磷酸酶(ALP)偶联的二抗，因为其灵敏度较低。显影方法检测试剂盒对于HRP偶联的抗体，通常使用加强的化学发光(ECL)试剂盒作为底物。我们提供不同检测灵敏度的HRP底物。X射线胶片自动化X射线胶片仪，简单易用，被广泛使用。切记，过曝的胶片不适合进行分析，因为无法确定蛋白的相对量。且过曝的