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AHI1基因启动子的克隆及转录活性的鉴定 05硕罗艺指导老师孟宪芳李熳2006 11 3 研究背景 Joubert综合征常染色体遗传病临床表现 小脑共济失调 双眼运动不能 肌张力减弱 病因 发育过程中小脑齿状核和皮质脊髓束的神经元轴突不能穿越中线形成神经交叉 立论依据 动物实验 小鼠同源基因Ahi1在小脑齿状核和深部第五层皮层神经元中高表达 齿状核神经元轴突穿越中线 参与形成小脑上脚 而深部皮层神经元的轴突形成皮质脊髓束 当Ahi1基因发生突变 小脑齿状核神经元和深部皮层神经元的轴突则不能穿越中线 表现出Joubert综合征 研究表明 Joubert综合征家系的患者有AHI1基因的移码突变和错义突变 结论 AHI1基因在皮质脊髓束和小脑齿状核神经元穿越中线的过程中发挥着重要作用 AHI1基因基因结构 6q23 2 含有28个外显子表达部位 成年人小脑和大脑皮质中高表达当前进展 至今AHI1基因的表达调控机制尚不清楚 研究内容 本课题拟通过研究AHI1的转录调控机制 以揭示Joubert综合征的发生机理和神经系统发育过程中神经元穿越中线的分子机制 研究方法 利用生物信息学软件预测分析转录调控信息利用基因工程方法验证不同长度AHI15 端侧翼序列是否具有启动调控活性在生物信息学基础上 以EMSA法分析与之结合的因子将已克隆入pEGFP 1的AHI1转录活性序列及与之结合的调节因子ORF的重组子共转染细胞 通过分析荧光蛋白活性分析反式作用因子对AHI1转录的影响 技术路线 预测AHI1基因的转录调控信息 在Genbank中找到AHI1的基因组序列 No NT 025741 利用Promoter2 0 Genescan等软件分析AHI1基因序列 预测启动子的位置 用CapsiteHunting法确定转录起始位点 重组克隆不同长度的5 端侧翼序列 根据预测的启动子位置设计上游下游引物 通过PCR扩增含有启动子的不同长度5 端侧翼序列 以pEGFP 1质粒为载体 重组克隆不同长度5 端侧翼序列 转染真核细胞cos 7 通过分析绿色荧光蛋白表达的有无和亮度确定具有转录活性的序列 5 端侧翼序列 阴性对照组 pEGFP 1 阳性对照组 pEGFP N1 实验组 AHI1 pEGFP 1 通过生物信息学分析能与具有转录活性的序列相结合的调节因子 以EMSA法验证 EMSA ElectrophoreticMobilityShiftAssay 电泳迁移率实验 将分别含有调节因子ORF和调控活性序列的重组子共转染cos 7 通过分析绿色荧光蛋白表达的有无和亮度 分析调节因子对AHI1基因转录的影响 实验设计 对照组 含AHI1启动子序列的重组pEGFP 1转染COS 7 实验组 AHI1启动子序列的重组pEGFP 1编码调节因子ORF的重组子 共转染COS 7 预期结果 确定AHI1转录起
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