骨骼肌核质线粒体分离技术.doc

骨骼肌组织分离细胞核、胞浆、线粒体1 50mg胫前肌组织，置于已预冷的玻璃培养皿，用剪刀剪碎。2 剪碎的组织加入300-500uL STM buffer，于冰上研磨1min以使均质化（using a tight-fitting Teflon pestle attach to a potter S homogenizer set to 600-1000rpm），检查组织是否已均匀化，若否，重做均质化步骤。3 均质化组织加入离心管，冰浴30min，最大速度离心15秒，4。然后800g 离心15分钟。沉淀标志为P0，上清S0。 沉淀P04 沉淀P0为细胞核和细胞碎片残骸。用300-500uL STM溶液重悬，最大速度vortex 15秒，500g离心15min 。沉淀标为P1，上清S1弃去。此时可以用显微镜检测细胞核纯度：取P1少量溶于台盼蓝溶液，放入血球计数器（haemocytometer）显微镜下检测，若其中含有很多细胞碎片，则重复此步操作。5 此步为提高P1的纯度：将步骤4沉淀重悬于300-500uL 的STM溶液，最大速vortex 15秒，然后1000g 离心15min ，沉淀标识为P5 ， 上清S5弃去。6 用200-500uL 的NET重悬，用枪头吹打至均匀（using a pipette to triturate until homogeneous），最大速vortex 15秒，置冰上30min ，该组分即含有nuclei组分，超声（at a high setting for 10-15s with 30s pauses whilst being kept on ice throughout.）9000g 离心30分钟，4。上清S6 即为nuclear fraction。上清S07 S0：cytosolic and mitochondrial fractions 。离心800g ，10min ，上清S2保留，沉淀P2可弃去亦可与P0合并。8 S2 11000 g 10min 离心，上清S3（包含cytosol and microsomal fraction）用冷的纯（100%）丙酮在-20沉淀至少1小时后12000 ，5min 。沉淀P7重悬于100-300ul的STM buffer，标志为 cytosolic fraction，其中可能包含一些微粒体（microsomal content）。9 沉淀P3重悬于100-200uL的STM ,11000g 离心10分钟，沉淀P4为线粒体组分。该组分重悬于SOL buffer，超声（at high seting for 5-10 seconds with 30 second pauses ）标志为 mitochondrial fraction。Buffers:STM: 250mM sucrose 50mM Tris-HCl pH7.4 5mM MgCl2 Protease and phosphatase inhibitor cocktailsNET HEPES pH 7.9 MgCl2 0.5M EDTA 0.2mM Glycerol 20% Triton-X-100 1% Protease and phosphatase inhibitor cocktailsSOL Tris HCl 50mM pH 6.8 EDTA 1mM Triton-X-100 0.5% Protease and phosphatase inhibitor cocktails文献：a simple p