临床ELISA检验影响因素

临床ELISA检验影响因素,临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下：,一.临床标本的收集和保存,用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨46点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：,（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。,（2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。,（3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70以下。,（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。,（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。,二、试剂准备,在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。,三、加血清样本及反应试剂,在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。,四、温育,温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37和室温，其次是43和28。,温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37 30分钟1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37 12小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：,（1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。,（2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37下1小时，另一种则为43下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如28下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。,（3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25左右）置于37温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。,总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。,五、洗板,固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限,在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置23分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤34次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。,六、显色,在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37或室温反应1530分钟。从理论上说，3730分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37下反应2530分钟后，终止反应比色测定。,此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。,七、比色,ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点：,（1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。,（2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。,八、结果判定,临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。,下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。 （1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。,九、结果报告及解释,临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。 综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。,临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因,失控原因 实验表现 S/Co值 处理方法 质控品因素 加入质控品量错误（多或少） 质控孔显色加深或变浅 高或低 加入正确质控品量，重 新检测质控品 加样器不准，加入质控品量 质控孔显色加深或变浅 高或低 校准或使用新的加样器 不准确 具，重新检测质控品 加样头未固定好，加入质控 质控孔显色变浅 低 加样头充分固定在加样器 品量不准确 上，重新检测质控品 加样器吸入、排出过快或未 质控孔显色变浅 低 采用适当的吸、排液操作 排至第二停点使加入质控品 方法，重新检测 量不准确 质控品开启时间过长、反复 质控孔显色变浅 低 更换同批号质控品，重新 冻融或保存不当致待检物效 检测质控品 价降低 质控品过期、污染 质控孔显色加深或变浅 高或低 更换同批号质控品，重新 检测质控品 质控品密封不好，水分挥发 质控孔显色加深 高 更换同批号质控品，重新 检测质控品 设置CO公式错误 S/Co值错误 高或低 未超过比色时间，修正公 式，重新比色 选择比色波长不正确 OD值低 一般为低 未超过比色时间，纠正比 色波长，重新比色,失控原因 实验表现 S/Co值 处理方法,试剂因素 试剂过期 全板显色浅 低 更换有效试剂，重新实验 试剂保存不当（如置入冷冻层 全板显色浅 低 选用保存妥当的试剂或购买 或室温保存等） 合格试剂，重新实验 酶标板、试剂在室温平衡不够， 造成酶标板包被物潮解或试剂 全板显色浅 低 使用在室温充分平衡的试剂 反应不足 重新检测 酶失效（酶污染长菌、保存不 全板显色浅 低 更换新的符合质量要求的酶 当等） 重新实验 酶标板失效（包装拆封时间长、 全板显色浅 低 注意拆封后的保存方法和 没有密封保存等） 使用期限，使用合格的酶 标板，重新实验 试剂盒存在质量问题 不显色或 低 更换质量可靠的试剂，加强 显色浅 对制剂盒质量的监测，必要 时重新评价实验室靶值和控 制限,失控原因 实验表现 S/Co值 处理方法仪器因素 洗板机洗板次数设定过少， 全板显色加深 高或低 调整洗板次数，重新实验 洗板不干净 洗板机洗板次数设定过多， 全板显色浅 低 调整洗板次数，重新实验 洗板过度 洗板机洗板注液速度过快 全板显色浅 低 调整洗板速度，重新实验 洗板机洗板吸液位置过高， 全板显色或花板 高或低 调整洗板机吸液位置高度，重新 洗板不干净 实验 洗板机洗板注入洗液量不 全板显色或花板 高或低 如因设置原因，调整设置，重新 足，洗板不干净 实验 洗板机洗液不足 全板显色或花板 高或低 开启洗板机液面感应功能，重新 实验，及时检查洗液液面 洗板机洗板注入洗液量过 部分孔显色加深， 高或低 设置调整，重新实验 多溢出，反应孔边缘酶污染 出现花板 酶标仪预热不够，未达到稳 比色结果不准确、 高或低 需要等候时间在比色时间允许范围 定工作状态 重复性差 内，等待充分预热后重新比色；需 要等候时间超出比色时间允许范围， 重新实验 酶标仪故障，比色结果不准 比色结果不准确、 高或低 维修酶标仪，重新实验 确 重复性差,失控原因 实验表现 S/Co值 处理方法操作因素 未加入酶结合物 全板不显色 低 重新实验,按试剂盒要求加入 酶结合物未加入或部分漏加底物 全板不显色或花板 高或低 重新实验,按试剂盒要求加入 底物试剂或样本加入量错误 全板显色加深或变浅 高或低 按试剂盒说明要求准确加入 试剂或样本, 重新实验某一步或多步孵育时间 全板显色加深或变浅 高或低 按试剂盒说明要求准确控制过长或过短 孵育时间, 重新实验加入试剂后未振摇或振 全板或部分孔显色变 高或低 重新实验,严格按要求实验摇不充分 浅或重复性差空白孔加酶 空白孔显色 低 空白孔一般不加酶,按试剂盒 要求操作包被反应孔条放置不平 部分孔显色加深, 高或低 重新实验,将反应孔条压紧、导致洗板不干净 重复性差 压平人工洗板，操作不规范 全板显色加深或变浅 高或低 使用洗板机洗板,重新实验 重复性差,失控原因 实验表现 S/Co值 处理方法操作因素洗液中忘记加入浓缩洗涤 全板显色加深 一般为低 重新按要求配置洗液,造成洗板不干净 液,重新实验洗液配制浓度过高,导致使 全板显色变浅 低 重新按要求配置洗液, 包被于固相上的抗原或抗 重新实验体解吸附 实验板孵育