荧光素FITC标记抗体的方法.doc

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个，一个IgG分子可结合28个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。1Marsshall法(1)材料 抗体球蛋白溶液、05molL(pH90)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH72或30的001molLPBS等。(2)方法及步骤 抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mgml，碳酸盐缓冲液容量为总量的110，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)510min。荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加001mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。a蛋白溶液：含量Amgm1；容积Bml。b总蛋白量(AXB)Crag。cC20C10Dmg(如蛋白含量低于20mgml，用C10；如高于20mgml，用C20)。d荧光素FITC的量：(1502100)XCEmg。e巳05molL(pH95)碳酸盐缓冲液D10Fml。f PBS量D-(B+F)=Gml。注：A为蛋白含量，mgml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在510min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4冰箱中。透析 结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500rmin)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH80缓冲盐水透析(04C)过夜。过柱 取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：001molL磷酸盐缓冲液(pH72)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释17倍左右)。2Chadwick法(1)试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、001mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。(2)方法及步骤 抗体准备 用o4C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为3040mgml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。荧光色素准备 按每毫克免疫球蛋白加入荧光素001rug计算，称取所需的荧光素，用3碳酸钠水溶液溶解。将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o4C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)1824h。透析和柱层析 方法同Marsshall法。3改良法(1)试剂和材料 001molL(pH72)PBS配法中，校定pH至72。NaCi 18g、Na2HP04 115g，溶于2000ml蒸馏水05molL(pH90)碳酸盐缓冲液配法 取05molLNazCOs(53)10ml加入05molLNaHC03(42)90ml，混合后，校定pH至90。3碳酸钠水溶液配法 称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。其他试剂和材料 l叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。(2)方法及步骤 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(015molLNaCl)及缓冲液(05molLNaHC03Na2C03，pH90)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10，降温至4。加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素蛋白：荧光素(5080)mglmg，在04下电磁搅拌1214h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o01，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4)可以用半年以上，一20C保存可达2年以上。4透析标记法此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。(1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。(2)方法及步骤 用0025molL碳酸盐缓冲液pH90，将欲标记免疫球蛋白稀释成1浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成01mgml的溶液，按10mgml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4中。 FITCCAS#：3326-32-7中文名：异硫氰酸荧光素英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC结构式：分子式：C21H11NO5S分子量：389.38性质：1. 外观：黄色粉末2. 纯度：95% (HPLC)3. 产品描述： FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。4. FITC标记抗体流程：（1） 将待交联的蛋白（浓度1mg/mL）对交联反应液透析三次4 ，至pH9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。（2） 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。（3） 按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150g 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 反应8 h。（4） 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 终止反应2 h。（5） 将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。（6） 交联物的鉴