临床免疫学免疫电泳技术.doc

第七章免疫电泳技术本章考点1.概述2.免疫电泳技术3.应用免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。第一节基本原理一、原理 免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。影响因素有：电场强度；溶液pH；离子强度；电渗等。二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。影响因素有：电场强度；溶液pH；离子强度；电渗。三、常用载体有琼脂和琼脂糖凝胶。其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。第二节常用技术免疫电泳常用技术有：1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。本法敏感度比双向扩散试验高816倍。图23 对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性2.火箭免疫电泳：火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。实质上是加速度的单向扩散。当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比例时。形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭状沉淀，峰形高度与抗原量成正相关。当琼脂中抗体量固定时，以不同浓度的抗原泳动的沉淀峰高度绘制标准曲线。图24 火箭电泳（1）（2）（3）为标本（4）（5）（6）为标准抗原3.免疫电泳：是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术。检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2.0mm宽的小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同，分离成若干肉眼不可见的区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，根据抗原电泳位置、含量及与抗体比例不同，而出现不同位置、不同形状和不同大小的沉淀线。待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品的成分及性质进行分析。此技术为定性试验，目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定。图25 免疫电泳示意图4.免疫固定电泳：这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上。参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。 第三节免疫电泳技术临床应用免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面；火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定gml以上的含量，目前较多应用于放射自显影技术；免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定，此外免疫固定电泳也用于尿液中本周蛋白的检测及、分型、脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。习题38 在对流免疫电泳中，抗体向阴性移动的原因是A.抗体带正电B.抗体带负电C.扩散作用D.电泳作用E.电渗作用答疑编号500734070101正确答案E答案解析通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。习题39 对流免疫电泳沉淀线出现在抗体阳极一侧，说明A.抗原强阳性B.抗原阳性C.抗原弱阳性D.抗原阴性E.与抗原抗体无关答疑编号500734070102正确答案A（见解析）答案解析 对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性第八章放射免疫分析本章考点1.概述2.放射免疫分析3.免疫放射分析4.应用第一节概 述 放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。此技术灵敏度高（可检测到ng、pg水平）、特异性强、重复性好、样品及试剂用量小是其优点，但核素的放射性，对工作人员和环境易造成危害或污染，是其缺点。放射免疫分析常用的放射性核素有：125I、130I、3H、14C等。放射免疫分析基本类型有：放射免疫分析（RIA）、免疫放射分析（IRMA）。广义上还应包括放射受体分析及放射配体结合分析。 第二节放射免疫分析（RIA） 1.放射免疫分析（RIA）基本原理：其原理为标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量特异性抗体竞争性结合反应。Ag*是试剂成分，而Ag是待测抗原，Ab也是试剂中成分。 Ag*和Ab的量是固定微量的，而待测的Ag量是不固定的。解释：如果将Ag*-Ab复合物与游离（剩余的）Ag*分开，分别测定它们的放射性，就可算出结合态的标记抗原（B： Ag*-Ab复合物中的Ag*）与游离态的标记抗原（F： 单独、剩余的Ag*）的比值（B/F），或算出结合率B/（B+F），它们与待测Ag量呈函数关系（反比关系）。2.剂量反应曲线：剂量反应曲线又称标准曲线，即用标准物浓度（Ag）对结合率B/（B+F）作图。在RIA中被测定物质的浓度（量）可从标准曲线上查得；同时标准曲线又是验证方法的灵敏度、检验抗血清质量和鉴定标准品纯度的主要依据。随着计算机的普及，可通过计算机的放免处理程序来绘制标准曲线。3.测定方法：RIA测定方法分三个步骤即：待测标本中未标记抗原，标记抗原和抗体进行竞争抑制反应；将标记抗原和抗体相结合的复合物（B）和未结合的标记抗原（F）的分离（分离方法有第二抗体法、聚乙二醇沉淀法、PR法、活性炭吸附法等）；对B进行放射性强度的测定（B为标记抗原抗体复合物，F为游离标记抗原）。根据标准曲线查得待测抗原浓度。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物） 第三节免疫放射分析（IRMA） 免疫放射分析（IRMA）是从RIA基础上发展起来的核素标记免疫测定。其特点是用核素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。1.基本原理：IRMA属于非竞争性免疫结合反应，是将放射性核素标记抗体，用过量的标记抗体（Ab*）与待测抗原反应（反应式为Ag+Ab*=Ag-Ab*+Ab*）。待充分反应后，除去游离的标记抗体，Ag-Ab*+Ab*结合物的放射性强度与待测抗原呈正比关系2.IRMA与RIA的异同点见表4-8-1。表4-8-1IRMA与RIA的异同点RIAIRMA标记物质核素标记抗原核素标记抗体反应速度较慢较快反应模式竞争抑制非竞争结合标准曲线的工作浓度针对多克隆抗体特异性较低针对单克隆抗体特异性较强标准曲线的工作浓度23数量级3个数量级以上分析误差加样误差严重影响结果较小其他可测大分子量与小分子量的物质只能测定在分子上具有2个以上抗原表位物质标记物限量过量第四节放射免疫分析在医学中的应用放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高，并可测定小分子量和大分子量物质，所以在医学检验中应用广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CAl25、CAl99等）和药物（如巴比妥、氨丙嗪）等。由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员亦须经过特殊训练。核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。近年来标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析仪有被取代的趋势。习题40 在RIA检测中，其结合率用于B/B+F表示，其意义是A.结合态的标记抗原与总的标记抗原之比B.结合态的标记抗原与游离的标记抗原之比C.总标记抗原与抗原抗体复合物之比D.结合态抗原与总抗体之比E.结合态抗原与总抗原之比答疑编号500734080101正确答案A答案解析结合态的标记抗原（B： Ag*-Ab复合物中的Ag*）与游离态的标记抗原（F：单独、剩余的Ag*）的比值（B/F），或算出结合率B/（B+F）习题41 关于RIA原理，正确的是当Ag增多时A.B/F值增大B.B/（B+F）值减少 C.B增多D.B+F减少E.F减少答疑编号500734080102正确答案B答案解析B为结合态标记抗原，F为游离态标记抗原。B+F为总标记抗原（结合态+游离态）。B/B+F为结合率，结合率与待测抗原量成反比。习题42 下列有关放射免疫分析（RIA）的叙述中，错误的是A.以放射性核素作为标记物B.是一种定量检测技术C.主要用于检测抗原D.最后形成的免疫复合物中的放射性强度与标本中待测物质含量呈正比E.定量分析时需先做标准曲线答疑编号500734080103正确答案D答案解析成反比关系。习题43 用RIA检测某种激素在血清中的浓度时，其抗原抗体复合物中放射性强度越大，表明A.该激素在血清中浓度越高 B.该激素在血清中浓度越低C.游离的标记激素的浓度越高D.对这种激素的特异性抗体浓度越高E.该激素及游离的标记激素的浓度越高答疑编号500734080104正确答案B习题44 目前，RIA在下列哪项检测上使用较少A.内分泌激素B.药物监测C.肿瘤标记物D.细菌抗原E.微量蛋白质答疑编号500734080105正确答案D习题45 RIA中标记的鉴定指标是A.放射性碘的含量B.放射性游离碘的含量C.标记前的免疫活性D.标记后的免疫活性E.放射性比度答疑编号500734080106正确答案B、D、E习题46 用125I标记抗原，不正确的是A.直接标记法仅用于含酪氨酸的化合物 B.间接标记法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白C.T氯胺标记法是最常用的直接标记法D.间接法标记蛋白质的比较放射性高于直接法E.间接标记法对蛋白质的损伤较小答疑编号500734080107正确答案D（见解析）答案解析用放射性同位素125I标记抗原有直接法和间接法两种方法。直接法最常用的是T氯胺标记法，标记率高低与抗原分子中酪氨酸含量及酪氨酸暴露程度有关。间接法是先将T氯胺与