核糖体展示技术(精选PPT)

核糖体展示技术 1 2 基因控制生物性状 基因指导蛋白质合成的过程 叫基因的表达 问题 基因是怎样指导蛋白质的合成呢 2 2020 4 21 细胞质 细胞核 核孔 DNA mRNA在细胞核中合成 3 2020 4 21 甲硫氨酸 核糖体 4 2020 4 21 tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置 5 2020 4 21 两个氨基酸分子缩合 缩合 6 2020 4 21 亮氨酸 核糖体随着mRNA滑动 另一个tRNA上的碱基与mRNA上的密码子配对 7 2020 4 21 亮氨酸 一个个氨基酸分子缩合成链状结构 8 2020 4 21 亮氨酸 天门冬酰氨 tRNA离开 再去转运新的氨基酸 9 2020 4 21 亮氨酸 天门冬酰氨 异亮氨酸 以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质 10 2020 4 21 1 核糖体展示技术原理 核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强有力的工具 通过将基因型和蛋白表型联系在一起 利用目标蛋白的特异性配基从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白和相应基因序列 原理 对体外进行转录与翻译 编码蛋白的DNA进行特殊的加工与修饰 如 去掉3 末端终止密码子或者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以共价键的形式联系起来 使得核糖体 mRNA 蛋白质三元复合物稳 11 2020 4 21 定 然后利用ELISA微孔或磁珠筛选出含有目标蛋白的核糖体三聚体 对筛选得到的复合物进行分解 释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应 RT PCR PCR产物进入下一轮循环 经过多次循环 最终使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离 见图1 12 2020 4 21 体外核糖体展示肽库构建与筛选原理示意图 13 2020 4 21 2具体方法 1 基因片段的改造为了使基因片段能有效转录和翻译 5 端应接上T7启动子序列和SD序列 去掉3 端的终止密码子 从而成功地使核糖体停留在mRNA3 末端 将蛋白质和mRNA连接在一起 在对基因片段改造时 常进行多次延伸PCR 分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来 14 2020 4 21 用引物4和引物5做连接PCR将目的基因和间隔子连接起来 引物5含有SD序列 引物4含有3 端茎环结构序列 PCR产物再进行延伸PCR 引物6含有T7启动子序列和5 端茎环结构序列 下游产物同前 最后得到的PCR产物 5 端接上T7启动子和茎环结构以及SD序列 3 端则融合了间隔序列并含有3 端的茎环结构 见图2 15 2020 4 21 16 2020 4 21 2 体外转录和翻译 体外表达可以利用来自原核的E coliS30无细胞蛋白质合成系统 或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统 至于何种系统更适合 目前尚有争议 体外转录与体外翻译可以偶联进行 也可以分别进行 目前 已有以DNA为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世 17 2020 4 21 对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质 转录和翻译应分别进行 因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠 但转录时 T7RNA聚合酶要求具还原性的 巯基乙醇维持其稳定性 如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠 则体外转录 翻译偶联体系效果可能更好 18 2020 4 21 若分别进行 则需要控制RNase的影响 VRC 过渡态类似物 作为RNase抑制剂 能有效抑制核酸酶 提高E coli核糖体展示效率 翻译结束后立即冷却反应混合物 所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响 另外 3 端和5 端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNase 和核酸内切酶RNaseE的影响 19 2020 4 21 3 亲和筛选 体外翻译反应结束后 将翻译混合物稀释4倍终止反应 反应试剂中始终保持5mmol LMg2 浓度 稳定mRNA 核糖体 蛋白质三元复合体 可以直接用于筛选实验 也可以于4 保存 核糖体复合物在4 至少可以稳定10d 但产量会逐渐减少 体外筛选时加入1 2 脱脂奶粉和0 2 肝素可以降低抗原 抗体的非特异性反应 肝素还能抑制核酸酶 20 2020 4 21 亲和筛选分为固相筛选和液相筛选 主要有ELISA和磁珠法 Hanes等认为 ELISA方法中 抗原包被在塑料表面上 而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象 从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位 磁珠法是在抗原上连接捕获标签 如生物素 然后在形成抗原 抗体复合物后 采用磁珠 链霉亲和素捕获该标签 进行亲和筛选 21 2020 4 21 22 2020 4 21 mRNA的分离 筛选完后 加入含20mmol LEDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA 洗脱下来的mRNA用DNase 处理去除残留的DNA模板 进行RT PCR反应重新引入T7启动子 SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交 评价筛选效率 将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接 转化到大肠杆菌中 可以得到单个靶标克隆 进一步采用体外或体内 分泌型或包涵体型 表达方式表达单链抗体分子 进行活性鉴定 23 2020 4 21 4 体外分子定向进化 用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时 可以通过易错PCR或 DNAshuffering 等方法引入突变和重组技术 增加分子多样性 从而提高获得高亲和力 良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率 Pl ckthumx小组利用核糖体展示技术筛选到1 1nmol高亲和力的ScFv 之后通过引入DNA重排技术 又将其亲和力提高了30倍 24 2020 4 21 3核糖体展示技术的优势 问题 展望 a优势 核糖体展示技术完全在体外进行 与噬菌体或酵母菌展示技术相比具有建库简单 库容量大 分子多样性强 筛选方法简便 无需选择压力 还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点 是一种筛选大型文库和获取分子进化强有力的方法 b存在的问题 如何进一步地提高该系统的稳定性 25 2020 4 21 特别是如何防止mRNA的降解和形成稳固的蛋白质 核糖体 mRNA三聚体无疑是该技术的关键问题 如何提