微生物灭菌工艺

项目二 微生物发酵制药工艺,2.1 概述2.2 制药微生物生长与生产的关系2.3 制药微生物菌种建立2.4 制药微生物培养基制备2.5 灭菌工艺,制药工艺的灭菌,灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备、空间中所有生物的技术或工艺过程。发酵和细胞车间：无菌培养，培养基和空气无菌制剂车间：无菌洁净空间，设备无菌，原料无菌；制药用水：无菌纯净水相关工艺：需要验证,灭菌方法与原理培养基灭菌工艺空气除菌工艺,2.5 灭菌工艺,几个概念,杂菌：除生产菌以外的任何微生物。污染：感染杂菌的培养或发酵体系。消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。,1、化学灭菌2、物理灭菌,2.5.1 灭菌方法与原理,1、化学灭菌,用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。化学灭菌剂：氧化剂类等，卤化物类，有机化合物等。机理：与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。应用：皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。,常用的化学灭菌剂,2、物理灭菌,各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌辐射灭菌：高能量电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。局部空间和器皿表面灭菌干热灭菌：高温(140-180 1-2h或灼烧) 氧化、蛋白质变性和电解质浓缩等作用致死微生物。实验室器皿蒸汽灭菌：高温和蒸汽的穿透力，培养基灭菌过滤灭菌：物理截留微生物，无菌空气制备。,2.5.2 培养基灭菌,（1）微生物高温死亡动力学与灭菌的关系微生物受热死亡过程的一级动力学反应：dX/dt = kdX微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭菌时间越长。,1、灭菌设计,kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关通常：杀死芽孢的温度和时间为指标，X0.001。确保彻底灭菌，实际操作中增加50的保险系数。,灭菌时间与比死亡速率之间的关系,（2）培养基营养成分破坏动力学,与微生物死亡过程类似，营养物降解符合一级动力学：,C营养物浓度t反应时间kc降解常数,阿伦尼乌斯方程,kc与T温度的关系,A比例常数；E降解活化能R气体常数T绝对温度,（3）灭菌温度选择原则,实验测定：灭菌的活化能大于营养成分破坏的活化能每升高2，速率常数的增加倍数为Q2：一般化学反应Q2为1.52.0；(营养成分降解)杀灭芽胞的反应Q2为52；（灭菌）杀灭微生物细胞的反应Q2为35左右。（灭菌）,在热灭菌的过程中：同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。灭菌温度选择原则：达到灭菌要求的温度，但营养成分不被破坏的温度,（4）影响培养基灭菌的因素,微生物种类：不同的微生物k值不同。初始菌浓度：灭菌时间与初始菌浓度的对数成正比。灭菌时间和温度：温度越高，时间越短培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性；固体颗粒影响热穿透。 传热与混合状况：泡沫影响受热均匀度。 蒸汽中空气：降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。,高固形物含量，灭菌温度高,pH的影响,（5）灭菌高温对培养基质量的影响,破坏营养：成分降解，褐变，有毒害物质形成沉淀物：多肽类沉淀，磷酸盐和碳酸盐改变pH：一般降低，酸化,减少高温有害的措施,采用连续灭菌方法分别灭菌：含Ca或Fe的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，不易形成磷酸盐沉淀高温破坏的糖培养基：低压灭菌。高温破坏维生素等：过滤灭菌,2、分批灭菌操作方式,间歇灭菌,实罐灭菌：配制好培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度，使培养基和设备同时灭菌。特点：不需其他的附属设备，操作简便，手动。缺点：加热和冷却时间较长。营养成分损失较多，罐利用率低。适合小批量生产规模。,分批操作的灭菌过程温度时间变化,加热升温：维持灭菌温度：1530min，121；0.090.2 MPa冷却降温：每段对灭菌的贡献于取决时间长短。,分批灭菌的操作过程,预热：空气、夹套通蒸汽。加热升温：70，取样管、放料管通入蒸汽。维持保温：120，罐压0.1MPa，排气。调节进汽和排气量，维持30min。冷却降温：依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温。,四路出汽：排气、接种、进料和消沫剂管排气,三路进汽：空气、取样和出料口,（1）高温短时灭菌操作，连消：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行：加热器，保温设备，冷却器。,3、连续灭菌操作,（2）连续灭菌操作流程图,培养基与高压蒸汽在连销塔直接混匀，在2030s达到灭菌温度（130-140），由维持罐保持必需的杀菌时间，喷淋式冷却。,加热器：喷射式和塔式,保温设备：罐式和管式,冷却器：喷淋式、板式、真空冷却,蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统,蒸汽直接喷入生培养液，温度几乎立即上升到预定杀菌温度，由保温段管长度来保证必要的杀菌时间。,连续板式换热器组成的灭菌系统工艺流程图,在20s内达杀菌温度，经保温后，再板式热交换器另一段20s内冷却到发酵温度。,（3）连续灭菌操作过程,配料：配料罐，配制培养基。预热罐：定容和预加热。7090。加热器：培养基与蒸汽混合， 快速升到130140。维持罐：维持灭菌时间,57分钟。冷却管：培养基经过冷却水管冷却。 4050。输入灭菌的发酵罐中。,连续灭菌的特点,1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；2）热能利用合理，易于自动化控制；3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。5）对压力要求高，一般为0.45-0.8 MPa。,灭菌操作举例1,灭菌锅内灭菌,固体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持2030min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持1520min；玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098MPa，3060min。,手提式,卧式,立式,立式,灭菌操作举例2,种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌,从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min；灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过达到死角灭菌；灭菌完毕，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。,灭菌操作举例3,种子培养基实罐灭菌,从夹层通入蒸汽间接加热至80再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，直接加热关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121，维持30min。谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为12，维持2min。,灭菌操作举例4,发酵培养基实罐灭菌,夹层或盘管进蒸汽，间接加热90，关夹层蒸汽取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121，维持30min。谷氨酸发酵培养基含有生物素等生长因子，实罐灭菌25，维持15min。,灭菌操作举例5,发酵培养基连续灭菌,一般培养基为130，维持5min。谷氨酸发酵培养基为115，68min。,2.5.3 空气除菌操作工艺,好氧微生物需要氧气供应，通入空气。连续一定流量的压缩无灰、无油、无水、无杂质的无菌空气。空气流量：一般0.1-2.0。压强：0.2-0.4 MPa。空气质量：相对湿度小于70；比培养温度高230；洁净度20级，或失败率23。,1、发酵对空气的要求,2、工业制备大量空气的方法,加热灭菌：利用空气压缩时所产生的热量（达200）除菌，无菌化程度不高的发酵过程。静电除菌：通过高压电流场，带电粒子被吸附。介质过滤：捕集粒子及各种微生物。发酵工业采用 可靠，经济，方便。,3、空气除菌原理,空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5um。空气运动通过深层过滤介质时：离心场作用：颗粒及其微生物沉降直接被截留：颗粒惯性碰撞，相互集聚成大颗粒。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。静电引力：微生物微粒带不同的电荷，与异性电荷吸引而沉降，有一定作用。,4、空气过滤介质,膜过滤介质：孔径小于被截留微生物体积硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜，四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。孔径0.1-0.5um深层过滤介质：空隙大于被截留微生物体积。纤维状或颗粒状：棉花(16-20um直径，空隙2050um)、玻璃纤维（1819um）、活性炭过滤纸：超细玻璃纤维纸(直径1-1.5um)金属烧结管：单根或几十根甚至上百根金属微孔滤管安装在过滤器内。,粗过滤,压缩机,储罐,冷却器,丝网分离器,过滤器,5、空气灭菌工艺过程,I:空气预处理,II：除去空气中油和水,III：空气过滤,（I）空气预处理,目的：提高空气的洁净度措施：(1)高空取气，提高空气吸入口位置，采风塔高，设计流速8m/s。每升2m，空气杂菌降一个数量级。 (2)加强过滤，空压机吸入口前安装粗过滤器。流速0.1-0.5 m/s。,空气压缩机与空气储罐,空气压缩机：提供空气流动的动力。 往复式、螺杆式、涡轮式空压机。空气储罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。设置在空压站附近。,空气冷却器,作用：降温，除潮。压缩机出口空气120150，需要冷却至2025。分级冷却，两级串联使用。第一级：循环水（30）冷却，至4050第二级：低温水（9）或地下水（1518）冷却，至2025。设置在发酵车间外。,（II）除油除水气液分离设备,除去空气中油和水：冷却空气湿度20，形成油滴和水滴。旋风分离器：空气速度1525m/s。完全除去20um以上离子，对2um离子的分离效率为6070。丝网除沫器：1um以上雾滴除去率98,（II）除油除水空气加热设备,温度下降形成水滴：加热空气，3035，降低相对湿度（从20到70以下），才能进入空气过滤器。列管式换热器：空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器：空气走管程，蒸汽走夹套。,（III）无菌空气空气过滤器,实验室：一级过滤器；生产规模设置二、三级过滤器，第一级为总过滤器，二、三级为分过