第四章-工业微生物分离与筛选.ppt

第四章工业微生物分离与筛选 CompanyLogo 本章内容 含微生物样品的富集培养 含微生物样品的采集 工业微生物的常规分离 目的微生物的筛选 毒性试验及性能鉴定 CompanyLogo 定方案 首先查阅资料 了解所需菌种的生长培养特性 采样 有针对性地采集样品 增殖 人为地通过控制养分或培条件 使所需菌种增殖培养后 在数量上占优势 分离 利用分离技术得到纯种 发酵性能测定 进行生产性能测定 这些特性包括形态 培养特征 营养要求 生理生化特性 发酵周期 产品品种和产量 耐受最高温度 生长和发酵最适温度 最适pH值 提取工艺等 新菌种分离与筛选的步骤 CompanyLogo 一 菌种的来源根据资料直接向有科研单位 高等院校 工厂或菌种保藏部门索取或购买 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 CompanyLogo 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求 菌种的特性 采用各种筛选方法 快速 准确地把所需要的菌种挑选出 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌 也必须重新进行分离纯化 二 分离思路 CompanyLogo 第一节含微生物样品的采集 一 从土壤中采集分布 细菌 放线菌 霉菌 酵母 藻类 原生动物1 土壤特点 有机质含量和通气状况5 25cm细菌 放线菌 5 10cm酵母 霉菌酸碱度和植被状况 CompanyLogo 地理条件季节条件 以温度适中 雨量不多的秋初为好 CompanyLogo 二 根据微生物生理生化类型采样1 根据微生物营养类型采样自养型 异养性 碳源不同 2 根据生理特性采样温度敏感型 氧敏感性 渗透压敏感型 酸碱型等3 特殊环境下采样 极端微生物 CompanyLogo 三 采样方式 1 土样采集森林 旱地 草地可先掘洞 由土壤下层向上层顺序采集 用小铲子除去表土 取离地面5 25cm处的土约10g 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 扎好 标记 记录采样时间 地点 环境条件等 为使土样中微生物的数量和类型尽少变化 样品要及时分离 CompanyLogo 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集 或可取离地面5 15cm处的土 在采集植物根际土样时 一般是自土壤中慢慢拔出植物根 在无菌水中浸渍约20min 洗去粘附在根上的土壤 然后再用无菌水漂洗下根部残留的土 这部分即为根际土样 采集工具 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲 土样采集器 镊子 解剖刀 手套 无菌小塑料袋和塑料瓶等 CompanyLogo 2 植物体采集 采集叶面一般用灭菌的剪刀 打孔器 安全刀片等 由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块 并注意不要损伤周围边缘 选择叶面时应考虑叶位 叶龄 叶片正反面和在一片叶上的取样部位 采集植物根及根系时 方法与根际土样采集方法相似 采集根系时 一般与根际土样一起保存 CompanyLogo 3 水样采集 水样应收集于100m1干净 灭菌的广口塑料瓶中 由于表层水中含有泥沙 故在采样时应在较深的静水层中采集水样 方法 握住采样瓶底浸入水中30 50cm处 然后瓶口朝下打开瓶盖 让水样进入 水样不应装满采样瓶 所有水样都应在24h之内迅速进行检测 或者4 下贮存 CompanyLogo 四 采样的注意事项 采样时应尽可能保持相对无菌 所采集的样本必须具有某种代表性 完整地标上样本的种类及采集日期 地点以及采集地点的地理 生态参数等 应充分考虑采样的季节性和时间因素 因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的 采好的样应及时处理 暂不能处理的也应贮存于4 下 时间不宜过长 CompanyLogo 1 营养成分 2 培养时间 温度 pH 3 抑制杂菌 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段 培养 固体 液体 分批连续 后使目的微生物在种群中占优势 第二节含微生物样品的富集培养 CompanyLogo 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株 所以筛选过程中 应及时调整检测方法 以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应 第三节工业微生物的常规分离 CompanyLogo 一 对工业微生物的基本要求 菌株应为 纯种培养 镜检无其它微生物 且无噬菌体感染 菌种具稳定的遗传性 必须能生长出可再生的单位 营养细胞 孢子种子质量好 各级种子罐的扩大培养要生长迅速 强健 微生物菌株是发酵生产成败的关键 CompanyLogo 1在短时间内可获得目的产物 3天或更短 2菌株的自我保护及采取措施 降低pH高温生长3目的产物多 且在多组分中易分离 CompanyLogo 二 含微生物样品的富集培养 控制培养基的营养成分控制培养条件抑制不需要的菌 CompanyLogo 从产物角度 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单 快速的鉴定方法 如抗生素 从形态的角度 菌落的外观形态 是微生物的一个重要表征 如多糖产生菌在适当的培养基上生长 从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别 三 分离方法确定 从生理的角度好氧型 厌氧型 CompanyLogo 1 生态学方法用于培养分离中 列出所要分离的微生物类群 根据所采集样本的各种生态参数 描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地 列出所要考察和测量的环境参数 如pH 盐分 水分 氧化还原电势及温度等 将样本分成若干类型 如植物和植物各部 土壤 类型和土层 岩石 水 昆虫和发酵食品等 列出生物系统中有用的自然底物 如森林土壤中的几丁质 葡萄表皮的果胶 CompanyLogo 根据上述5项中所获得的数据 设计分离方法 即选择适宜的稀释液 底物 试样 天然浸出汁和培养条件 用标准方法作对照来评价分离方法 根据待检材料的生态参数需要 修改已知的方法 运用特定的富集方法 富集那些可能具有筛选意义的微生物类群 CompanyLogo 2 生态学参数及培养基的组成原则 部分分离培养基中必须含有10 50 的天然提取物 加入培养基中的天然提取物 应含有多种碳 氮源 如几丁质 纤维素或果胶 所有分离培养基中都应含有抗真菌剂或抗细菌制剂 浓度约为50 g m1 琼脂平板使用前应置于37 培养箱中孵育l 2天 培养基的生物物理学参数 如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近 CompanyLogo 1分离培养微生物的常规操作 分离研究微生物要在无菌条件下进行 防杂菌污染 1操作在无菌室 无菌箱 超净工作台上进行 使用前用70 75 酒精棉球擦拭 2培养容器 试管 培养皿 要事先灭菌 培养时要加盖 以防污染 3接种用具 吸管 接种环 要灭菌4接种时塞子或盖要在火焰上过一下 三 菌种分离方法 CompanyLogo 2采样分离方法 1 从自然界采样分离 培养分离 挖土 稀释 接种 表面向下5cm 编号记录 1000 100万倍 取0 1 0 2ml稀释液 选用易生长发育的培养基 CompanyLogo 2 从检样分离 可采取下列方法从检样直接分离菌株 A把检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养 B取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中 C把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体培养基 D将土样连续几次在液体培养基中富集培养后 接入固体培养基中分离 CompanyLogo E 组织分离法 一般有病组织分离法消毒 冲洗 放在培养基上 分离 单一菌落食用菌孢子分离法多孢子分离法单孢子分离法 CompanyLogo 3微生物的接种培养方法 1 稀释平板培养法 定性 定量 加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养 对绝对厌氧菌的辅助措施培养用培养箱要预先去除氧并密闭 CompanyLogo 加还原剂 p72 加入半胱氨酸 维生素C 硫化钠等焦性没食子酸法平皿厌氧培养法试管厌气培养法玻璃板隔绝空气培养法生物吸氧法 CompanyLogo 2 厌氧菌的稀释转动分离培养法 琼脂试管加热溶解冷却至50 保持液态 接种一支试管 转动混合后取出1 10接入第二支试管 转动混合后再取出1 10接入第三支试管 依次类推 连续接种6 10支 冷却凝固 在琼脂培养基表面倾注一层无菌石蜡 防止空气中的氧气进入 CompanyLogo 4纯化分离菌种的方法 挑取首批菌落 菌悬液 无菌稀释液稀释 接种到培养皿培养 重复上述步骤 单孢子分离 稀释转动培养 挑取一个菌落 取一部分 观察 必要时 所有操作在无菌条件下进行 CompanyLogo 第四节有用微生物的筛选 筛选有用微生物是工业生产过程的第一步 筛选 从自然界某些含有菌群的材料中 用特定的操作程序分离并发现有用的微生物 一初筛二复筛三抗菌谱的测定 CompanyLogo 一 初筛 目的 得到具有潜在应用价值的目的微生物 初筛 一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰 把少量有用的微生物筛选出来 要求 快速 有预测或预见敏捷 迅速处理好众多的样品 经济 得到有广泛目标的有用微生物 CompanyLogo 筛选方法 琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛 1 用pH指示剂检测有无有机酸或胺类 中性麝香草酚蓝 pH 6 0黄 pH 7 6蓝 pH6 0 7 0绿2 在培养基中加入碳酸钙检测有机酸 可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区 3 在培养基中加入底物检测细胞外酶 酶抑制剂等特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应 酶的反应对特定底物形成溶解或沉淀 CompanyLogo 4各种抗生素产生菌的初筛 1 有代表性的常用试验菌 部分是病原菌 细菌 真菌 原虫 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 八叠球菌 肺炎双球菌 产气杆菌 大肠杆菌 痢疾杆菌 普通变形杆菌 黑曲霉 产黄青霉 烟曲霉菌 白色念珠 痢疾阿米巴 球虫 CompanyLogo 2 各种抗生素产生菌的初筛 采用抑菌圈法 亦称平板扩散法 杯碟法 方法 培养菌液 溶化的琼脂48 混合 倒平板 放检样杯碟 培养 无菌操作 有抑菌圈为阳性反应 CompanyLogo 二 复筛 微生物初筛鉴定发酵培养基的选择培养与发酵抽提试验 CompanyLogo 1 微生物初筛鉴定对初筛菌株进行分类 何属 何种 目的 预知微生物对人 动物或植物是否有致病性 或进行毒理实验 最短3月 长达2 5年但分类复杂 以前轻易不作 CompanyLogo 2发酵培养条件及培养基的选择 CompanyLogo 3培养与发酵 1 试管培养试管摇床培养 常用 目的 原种斜面培养后 为了提高初筛效率 2 摇瓶培养 摇瓶发酵 250或500ml锥形瓶再200rpm摇床上培养 目的 培养基和培养条件的初筛 CompanyLogo 3 玻璃自控发酵罐容量5 50L 是摇床向发酵罐的过渡阶段 目的 工艺参数 工艺条件的选择和考察 4 试验罐培养中间工业试验阶段目的 放大和验证摇床试验结果 积累发酵工艺规律和发酵参数 为工业规模生产打基础 CompanyLogo 发酵试验的四个阶段 CompanyLogo 4抽提试验 采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来 有四种方法 1溶媒抽提2用活性炭抽提3用树脂吸附洗脱4从菌丝体浸出抽提 CompanyLogo 例 新抗生素的抽提试验 发酵液 过滤 分离 离心 4菌丝体 浸出抽提 水抽提 甲醇抽提 过滤 过滤 蒸发 抗菌活性试验 甲醇浓缩液 清液 滤液 1在不同PH条件下向溶媒转移 2活性炭吸附洗脱 溶出洗脱 3树脂吸附洗脱 酸碱溶媒洗脱 抗性活性试验 CompanyLogo 例 聚 羟基丁酸酯及其共聚物P83 聚 羟基丁酸酯 PHB 是一种微生物合成的聚酯 PHB及其共聚物通称为聚羟基脂肪酸酯 PHA 是通过细菌培养产生的 PHA存在于细胞内 通过萃取取出 PHA重量可占细菌重的90 PHB和PHA具有生物