不同水生动物溶血性弧菌分离鉴定及调查 论文

不同水生动物溶血性弧菌分离鉴定及调查邓新裕 梁红茹 夏剑鹏指导老师：王林川教授摘要 副溶血性弧菌（V。parahemolyticus）于1950年从日本一次暴发性食物中毒中分离发现。该菌存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。根据菌体O抗原不同，现已有13个血清群。主要引起食物中毒，尤以日本、东南亚、美国及我国台北地区多见，也是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。弧菌性疾病是海水养殖中常见的一种疾病，给养殖业带来了较大的损失，近年来在我国的人工养殖发病死亡的海鱼和贝类等也分离到本菌，并在生产中长期滥用抗菌素，使得致病性弧菌对药物的耐药性不断增强，产生了许多新的耐药菌株，传统药物的治疗效果越来越差，海水养殖弧菌病的防治面临着新的挑战。关键词 副溶血性弧菌；淡水养殖；检测 副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,尤其是在夏秋季节,经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品或被此菌污染的食品,引起爆发性食物中毒,因此在食品检测和食物中毒调查、传染病源调查等工作中,经常需要对副溶血性弧菌等致病菌进行检测。传统的副溶血性弧菌检测法主要分为增菌培养、分离纯化、镜检和生化试验等步骤。而基于PCR技术的快速检测方法，能应用于日常检测工作中，特别是应用于食物中毒病原菌检测，使副溶血性弧菌的检测判定周期大幅缩短至24h，同时提高了检测准确度和灵敏度。同其它引起人类感染的弧菌种类一样，该菌与霍乱弧菌的一个显著差别是嗜盐（halophilic），在培养基中以含3.5%NaCl最为适宜，无盐则不能生长，但当NaCl浓度高于 8%时也不能生长。在盐浓度不适宜的培养基中，细菌呈长杆状或球杆状等多形态。不耐热，90C1分钟即被杀死；不耐酸，1%醋酸或50%食醋中1分钟死亡。副溶血性弧菌多存在于鱼蟹虾等水产品中，尤以海鲜带菌比较普偏。据调查，带菌率以黑鱼最高，达93%，梭子鱼79.8%，带鱼41.2%，黄鱼27.3%。有的国家从冷冻食品中分离到此菌。本菌也常发现于冷冻的熟海产品中，如加工后的对虾，龙虾等。但根据我国部分资料报道，长春市售冷冻及干燥海产品中均未检出活菌的存在，认为是低温，干燥，日射灯因素使之不能存活。华东地区沿海水域本菌检出率为57.4%-66.5%，海产品冬季的平均带菌率为45.6%48.7%，夏季可达90%以上。沿海附近的荷塘和井水中的副溶血性弧菌检出率可达42.4%，其他食物如肉类，禽类，淡水鱼均有本菌存在。因此引起食物中毒主要是海产品，鱼，虾，贝类，其次是肉类，家禽，鲜蛋等。另外，由于带菌海产品与其它食品同车运输，同库储存也会造成交叉污染。日本由于海产品食品较多，副溶血性弧菌成为一种极其严重的泻痢病源，50-70%肠炎病例由它所致。据广州市1967-1976年间的统计，副溶血性弧菌引起的食物中毒占食物中毒总数的13.3%。副溶血性弧菌食物中毒的机理不完全清楚，有的人认为是活菌侵入，属于感染性的；有人认为由于其产生的肠毒素引起的，属于毒素性的；也有人认为是由于活菌与毒素共同作用的结果，成混合型。对某地区的副溶血性弧菌的食品抽样调查中，水产品的阳性率是最高的。表I：某地区不同食品的副溶血性弧菌的检测结果样品名称 数量 副溶血性弧菌 检出率生猪肉 56 3 5.36%生牛肉 43 2 4.65%生羊肉 43 0 0生鸡肉 100 0 0熟肉制品 29 0 0生奶 20 3 15%水产品 50 9 18%冰淇淋 20 0 0蔬菜 37 0 0合计 398 17 4.27%为深入调查广州市周边养殖区水产品的副溶血弧菌感染情况，我们对广州市边区一些养殖场水产进行了采样调查，并通过实验室检查检查以予确认。1 实验材料和方法：1.1实验材料样品由老师及养殖场提供，为淡、海水养殖水生动物（包括鱼类、虾类、贝类、蟹类等），样品病症初步显示为溶血行弧菌感染，样品取样后尽快开始下步实验。1.2 肌肉病原分离及接种用酒精棉球擦拭净死鱼体表面粘液，用无菌剪刀剪开体腔，用无菌铂铒环在近酒精灯的火焰旁从肌肉病灶内挑取病料，病料划线接种于平板培养基肌肉那半边。无菌操作；1.3内脏病原分离及接种用酒精棉球擦拭净死鱼体表面粘液，用无菌剪刀剪开体腔，可见肝脏有一黑色的坏死点，用燃烧的酒精棉球灼烧肝脏表面，用无菌铂铒环在近酒精灯的火焰旁从肝脏病灶内挑取病料，病料划线接种于平板培养基肝脏那半边。无菌操作；1.4 菌体培养将上述接种有病料的SS培养基在28，恒温箱中培养24小时1.5 涂片染色镜检涂片、干燥、固定、染色都按常规方法，将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。 水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。水洗后用95酒精脱色。水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。 2试验结果：2.1 分离鉴定 细菌分离培养：1824h后,伊红美蓝琼脂平板无细菌生长，血琼脂平板上出现直径约3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，有a-溶血环出现。用克氏双糖铁管对菌落进行提纯。克氏双糖铁管培养基培养:该菌在克氏双糖铁培养基管上表现为葡萄糖发酵型细菌。菌体镜下观察:革兰氏染色为阴性略弯曲的杆菌，有的呈弧行，两端稍浓染，也有的呈多形性，排列不规则。直接取菌于盐水中，镜下观察该菌运动极活泼，呈流行，穿梭样运动。2.2生化反应 鉴定试验:根据该菌形态、动力、培养特性，无盐培养基不生长而在含3%6%的NaCl培养基中生长极好。氧化酶阳性，H2S阴性，尿素阴性，动力阳性，与霍乱弧菌多价血清不凝集等特征，可初步鉴定为嗜盐性弧菌。确证试验:该菌具有在无NaCl的1%蛋白胨水中不生长；在7%8%NaCl蛋白胨水中生长良好，而在10%NaCl蛋白胨水中不生长；葡萄糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阴性，肌醇阴性，淀粉酶阳性，蔗糖阴性，氧化酶阳性，吲哚阳性，明胶液化阳性的特征。表II副溶血性弧菌的生化性状项目 反应 项目 反应葡萄糖产酸 + 嗜盐性试验8% +葡萄糖产气 + 嗜盐性试验11% -蔗糖 - 甲基红 +乳糖 - 赖氨酸 +甘露醇 + 精氨酸 -动力 + 硫化氢 -溶血性 + 定基质 -嗜盐性试验0% - V-P -嗜盐性试验4% +2.3 药物敏感试验 采用纸片琼脂扩散法，结果显示该菌对大多数抗生素均敏感，如头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素类等。通过以上试验可以初步确定是：副溶血性弧菌表III不同水生动物副溶血性弧菌的检测种类 采样数 检出数 检出率鲤鱼 15 1 7%鲫鱼 12 0 0非洲鲫 10 1 10%鱿鱼 8 3 37.5%海虾 6 2 33.3%通过以上的实验和调查，对一些地区的养殖过程中出现的死鱼进行微生物学鉴定，以初步的鉴定结果得出在养殖过程中的微生物感染情况；针对几种主要的养殖鱼类进行了收集和分析，研究的鱼类包括鲤鱼，鲫鱼，青鱼，草鱼等。在防治和治疗，起到了积极的作用。而针对我国有过多次由于食用水产品而引发的一系列微生物中毒事件，病因的鉴定也具有参考价值。 讨论副溶血性弧菌是一种分布极广的海洋性细菌，该菌解体后放出的耐热性溶血素，在100以下，加热10 min 不被破坏。中毒时主要表现为恶心、呕吐、腹泻、腹痛，大便多为黄水样，有时出现血水便或带有脓血和黏液，重者脱水、虚脱，甚至休克。随着近年分子生物学的发展，对副溶血弧菌的研究更深入了一步，尤其是对其基因组DNA、质粒、鞭毛以及致病因子等方面的研究更是取得了长足的进展。目前研究认为，副溶血弧菌的致病因子有溶血性毒素、尿素酶、黏附因子和侵袭力。一般认为，Vp的主要致病作用是其可产生溶血毒素。主要的溶血毒素有耐热性溶血毒素(THD)和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素(TRH)，副溶血弧菌产生的耐热性溶血毒素(TDH)是重要的致病因子，临床上分离的副溶血弧菌株绝大多数可出现一种特殊的溶血现象，称为神奈川现象。尿素酶阳性的副溶血弧菌是近年来研究的热点，大量研究发现，尿素酶与细菌的致病性存在一定关系。很多研究表明，外毒素自身并不足以产生细菌的致病性。在肠内病原体引发疾病之前，菌体通常先黏附到肠上皮细胞，然后进行复制，产生毒力因子。是否存在菌毛之外的黏附机制尚需要进一步研究。Akeda等通过做药敏试验，发现21株副溶血弧菌中，有4株可对细胞产生侵袭作用，而细胞松弛素能阻断副溶血弧菌对细胞的侵袭力，这也表明酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导，鞭毛和细胞骨架可能在侵袭过程中发挥一定作用。参考文献:1 郑天伦,王国良,金珊. 海水养殖动物弧菌病防治的研究进展. 台湾海峡,2002 , 21 (3) ；2 莫照兰,茅云翔, 陈师勇, 等. 一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定J . 高技术通讯,2001 ；3 莫照兰,茅云翔, 陈师勇, 等. 养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析 J . 海洋与湖沼, 2003；4 东秀珠,蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册M . 北京:科学出版社,2001 ；5 兽医微生物