第4章 蛋白质折叠ppt课件

第四章蛋白质的折叠 4 1 概述4 2 蛋白质的自发折叠4 3 受助的蛋白质折叠4 4 蛋白质的折叠病4 5 研究蛋白质折叠的意义 蛋白质折叠的定义 蛋白质凭借相互作用在细胞环境 特定的酸碱度 温度等 下自己组装自己 这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠 4 1 概述 蛋白质折叠问题是生命科学领域的前沿课题之一 并且被列为 21世纪的生物物理学 的重要课题 它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题 从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能 是极富挑战性的工作 研究蛋白质折叠 尤其是折叠早期过程 即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题 蛋白质折叠研究的背景 遗传信息的传递 DNA RNA Proteins 肽链 有活性的蛋白质天然构象 实质上是多肽链 遗传信息的传递应该是从核苷酸序列到有完整结构的功能蛋白质的全过程 第二遗传密码 多肽链的一级结构决定它的空间结构 既然前者决定后者 一级结构和空间结构之间肯定存在某种确定的关系 这是否也像核苷酸通过 三联密码 决定氨基酸顺序那样有一套密码呢 后来 有人把这设想的一级结构决定空间结构的密码叫作 第二遗传密码 完整的提法应该是遗传密码的第二部分 即蛋白质中氨基酸序列与其空间结构的对应关系 国际上称之为第二遗传密码或折叠密码 第二遗传密码的特点 简并性在第一遗传密码中有所谓 简并性 即同一AA可以由不同密码子所编码 如CGA和AGC都编码为Arg UCC和AGU都编码为Ser等 第二密码也同样有简并性 现在已经知道有很多氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的空间结构 这就是第二密码的简并性 简并性的证据 不同生物体中执行相同功能的蛋白质有AA序列上的差异 但却有相同的整体空间结构 例如 线粒体Cytc的AA序列已经测定 AA残基数均在104左右 但在不同生物体的Cytc中仅有21个AA是完全相同的 但是所有Cytc的整体空间结构却是非常相似的 另外 两个在功能上完全无关的蛋白质 卵类黏蛋白的第三结构域和核糖体结构蛋白L7 L12的C 末端部分在AA序列上仅有3 相同 却具有几乎完全相同的空间结构 此外 对蛋白质进行化学修饰或定点突变 对分子的总体结构没有影响 多意性 某些相同的氨基酸序列还可以在不同条件下决定不同的空间结构 这种情况可以称之为第二遗传密码的多意性 例如 天然型朊病毒主要为 螺旋结构 而感染型的朊病毒却主要为 折叠结构 但二者一级结构相同 全局性 第二密码必须把蛋白分子作为一个全局来考虑 这就从根本上决定了第二密码的复杂性 它不可能像第一密码那样有简单的一对一的关系 某些蛋白C 末端少数氨基酸的去除 或侧链基团的翻译后修饰 有时都可以对整体构象和功能产生重大影响 在新生肽链合成过程中 后形成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响 第二密码的全局性还体现在环境对分子结构的影响上 水分子对于维系蛋白质一定的空间结构有重要作用 破译 第二遗传密码 正是 蛋白质结构预测 从理论上最直接地去解决蛋白质的折叠问题 这是蛋白质研究最后几个尚未揭示的奥秘之一 蛋白质折叠的研究内容 蛋白质折叠的研究 狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律 稳定性及与其生物活性的关系 在概念上有热力学的问题和动力学的问题 蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题 有理论研究和实验研究的问题 蛋白质折叠研究的概况 20世纪60年代 安芬森 Anfinsen 基于还原变性的牛胰RNase的研究提出 自组装学说 Ellis于1987年提出了蛋白质折叠的 辅助性组装学说 经典的蛋白质折叠自组装学说 实验基础 Fraekel Conral和Williams重组实验 20世纪50年代 烟草斑纹病毒外壳蛋白核糖核酸 在体外生理条件下重组得到有感染活力的病毒粒子 4 2 蛋白质的自发折叠 Anfinsen实验 8mol L尿素或6mol L盐酸胍及 巯基乙醇 透析去掉尿素及 巯基乙醇 让变性酶的巯基在空气中缓慢氧化 恢复其原有的二硫键 4个 和次级键 酶的活性又逐渐恢复 95 100 牛胰核糖核酸酶 随机重组 8个SH形成4个二硫键的概率是 1 7 1 5 1 3 1 105核糖核酸酶不仅重新折叠了 而且选择了105种可能方式中正确的一种 60年代 Anfinsen提出氨基酸序列决定了蛋白质特定三维空间结构的著名假说 self assembly的主导学说 蛋白质的氨基酸序列已经包含了它的三维结构的全部信息 一级结构决定高级结构 细胞内新合成的多肽链 在其合成终了之后 不需要别的分子的帮助 也不需要额外能量的补充 就应该能够自发地折叠而形成它的三维结构 所谓翻译后的自发折叠过程 体外实验结论扩展到体内 蛋白质折叠机制的理论模型 框架模型 FrameworkModel 疏水塌缩模型 HydrophobicCollapseModel 成核 凝聚 生长模型 Nuclear Condensation GrowthModel 拼版模型 Jig SawPuzzleModel 与大量现代实验相矛盾 有的蛋白复性效率很低 甘油醛 3 磷酸脱氢酶核糖核酸酶在较高蛋白质浓度 较高温度等接近生理条件下 复性效率也不高变性蛋白复性是一个较慢过程 几十分钟 新生肽链的折叠是一个快过程 几分钟 新生肽链的折叠的新观点 1 新生肽链的折叠是随着肽链的延伸同时进行折叠 又不断进行调整 协调动态过程 先形成的结构会作用于后合成的肽链的折叠 后形成的结构会影响已形成的结构的调整 新生肽链的合成 延伸 折叠 调整 三维结构 4 3 受助的蛋白质折叠 2 细胞内新生肽链的折叠和成熟为功能蛋白 一般来说是需要帮助的 而不是自发的 一类新的生物功能的蛋白 能够帮助细胞内的其它蛋白折叠 蛋白质的体外折叠与体内折叠 帮助新生肽折叠的蛋白 辅助蛋白 分子伴侣折叠酶分子内伴侣 分子伴侣 蛋白质的保姆 分子伴侣 Chaperone或molecularchaperone 也可译为侣伴蛋白 是细胞内的一类保守蛋白质 可识别肽链的非天然构象 促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠 分子伴侣概述 分子伴侣的作用机制实际上就是它如何识别靶蛋白 怎样与它结合 结合后会发生什么变化 在什么条件下又解离 解离后分子伴侣和靶蛋白又会如何等这样的问题 对此目前认识还很少 现在只知道分子伴侣识别折叠中间物的非天然构象 而不能识别天然的构象 几点说明 1 分子伴侣是从功能上定义的 凡具有这种功能的蛋白都是分子伴侣 它们的结构可以完全不同 可以是完全不同的蛋白 2 分子伴侣的作用通过催化的或非催化的方式 加速或减缓组装过程 传递组装所需要的空间信息 也可能只是抑制组装过程中不正确的副反应 3 分子伴侣一定不是最终组装完成的结构的组成部分一些蛋白酶的前导序列及核糖体蛋白的泛尾肽 分子内分子伴侣 4 分子伴侣帮助正确的 非共价组装 排除共价修饰酶 5 不仅帮助新生肽链的折叠 还帮助新生肽成熟为活性蛋白 包括转运 越膜定位 亚基组装等 最大一类蛋白为热激蛋白 Hsp60 Hsp70 Hsp90 到底非天然构象的什么特征能被分子伴侣识别呢 确切的原因还未知 目前只知道在天然构象中 疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核 去折叠后就可能暴露出来 或者在新生肽段的折叠过程中 会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面 因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合 分子伴侣的类型 HSP 后面的数字表示以kDa为单位的分子伴侣的分子量 GropES GropEL HSP40 DnaJ I型HSP40 II型HSP40 底物结合位置 尚缺乏N端J 结构域 该结构域能激活HSP70的ATP酶活性并调节Hsp70与底物的结合 HSP40 DnaJ I型HSP40 II型HSP40 底物结合位置 HSP40与HSP70相互作用示意图 底物 Hsp70作为一种重要的内源性保护因子 可提高肺组织对各种损伤的耐受性 肺组织中Hsp70表达的增加可减轻肺水肿及炎性反应 减少肺组织细胞凋亡 从而改善氧合功能 降低病死率 增加心脏组织中Hsp70基因的表达 可使心脏具有抵抗缺血或内毒素损伤的作用 Hsp70的其他功能 近几年 有关Hsp70的研究已成为分子生物学的一大热点 并逐渐成为临床多种疾病治疗的新途径 由于Hsp能够对各种形式的组织细胞损伤提供保护作用 随着研究的深人 应用药物或基因工程等技术诱导Hsp作为肺损伤的治疗方法颇具前景 GroEL HSP60 型伴侣素 存在于真细菌 线粒体和叶绿体中 由双层7个亚基组成的圆环组成 每个亚基分子量约为60Ku 它们在体内与一种辅助因子 如E coli中的GroES 协同作用以帮助蛋白折叠 除了叶绿体中的类似物外 这些蛋白是应急反应诱导的 GroEL的立体结构图 一个亚基 两个七亚基圆环 顶端结构域 中间结构域 赤道结构域 一个亚基 GroEL GroES GroES GroEL GroES GroEL GroES为7亚基组成的盘状结构 GroEL中的顶端结构域向上垂直移动以便和GroES相互作用 在未结合和结合GroES时GroEL结构域的重排 顶端结构域 中间结构域 赤道结构域 疏水面 顺式环 反式环 结合了ATP和GroES的GroEL 未结合配体的GroEL 球棍模型 疏水侧链 GroEL GroES系统促进蛋白质折叠过程 分子伴侣的主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境 折叠酶 蛋白质多肤链的折叠过程中 还需要酶的催化 称之为折叠酶 它们催化与蛋白质折叠直接有关的 对形成功能构象所必需的共价键变化 帮助蛋白质正确折叠 折叠酶类型 1 蛋白质二硫键异构酶PDI Proteindisulfideisomerase 2 肽基脯氨酰顺反异构酶PPI Peptidylprolylcis transisomerase 蛋白二硫键异构酶 proteindisulfideisomerases PDI 真核生物的PDI在内质网腔活性很高 细菌中的类似物是Dsb家族 位于细菌外周质 periplasm 在肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接 最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象 通过催化巯基与二硫键的交换反应 从而催化蛋白质二硫键的形成 还原 断裂 或重排 异构化 在蛋白质折叠过程中 主要催化含有二硫键的膜蛋白或分泌蛋白的正确折叠 细菌中含有二硫键蛋白质的氧化和异构化过程 DsbA蛋白负责氧化 DsbB是参与重新氧化DsbA的一个膜蛋白 还原形式的DsbC催化异构化过程 DsbC的还原态由DsbD维持 在真核生物中 只有PDI1个蛋白在内质网中既负责氧化也负责异构化过程 PDI的重新氧化由FAD依赖型内质网氧化还原蛋白完成 肽基脯氨酰顺反异构酶 PPI PPI广泛分布于各种生物体及各种组织中 多数定位于胞浆 但也存在于大肠杆菌的外周质 红色面包霉的线粒体基质 酵母 果蝇和哺乳动物的内质网 肽基脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶 在细胞中通过非共价键方式 稳定扭曲的酰胺过度态 而催化肽基脯氨酰顺反式的相互转变 在肽链合成后需形成顺式构型时 可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠 对于大多数肽键而言 反式比顺式稳定1000倍 反式 顺式 第二个残基为Pro的肽单元 普通肽单元 对于第二个残基为Pro的肽键而言 反式仅比顺式稳定4倍 结构 8个 折叠形成 折叠桶 外侧有两个 螺旋 结合部位通过结合含脯氨酸的四肽 绿色 而定位 肽基脯氨酰顺反异构酶 PDI和PPI不仅可以起到折叠酶的催化作用 而且具有防止折叠中间体聚集的类似分子伴侣的功能 王志珍等最早提出PDI是分子伴侣的假说并验证了PDI的这一功能 分子内伴侣 intramolecularchaperones 1987年 Ikemura发现枯草杆菌素 subtilisin 的折叠需要前肽 propeptide 的帮助 这类前肽常位于信号肽与成熟多肽之间 在蛋白质合成过程中与其介导的蛋白质多肽链是一前一后合成的 并以共价键相连接 是成熟多肽正确折叠所必需的 成熟多肽完成折叠后即通过水解作用与前肽脱离 Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣 4 4 蛋白质的折叠病 folddisease 蛋白质分子的氨基酸序列没有改变 即一级结构正常 只是其二级结构 乃至立体结构 构象 异常也可导致疾病 这类疾病称为 构象病 或称 折叠病 从本质上讲 分子伴侣突变引起的疾病蛋白折叠 转运异常引起的疾病 疯牛病 牛海绵状脑病 bovinespongiformencephalopathy BSE 俗称疯牛病 madcowdisease 1986年首次在英国报道 该病潜伏期4 5年 发病初期表现为体质变差 体重减轻 产奶量下降等非特异性症状 随后神经系统症状逐步明显 出现小脑共济失调 震颤等 由于病牛常表现出感觉过敏 恐惧甚至狂乱 因此俗称 疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白 prionprotein PrP 引起的一组人和动物神经退行性病变 PrP的一般性质朊病毒蛋白 PrP 是由宿主基因编码的 其编码蛋白有两种形式 一种是正常的细胞型PrP PrPc 属蛋白酶敏感型 是细胞的正常组分 另一种是异常的致病型PrP PrPsc 具有一定的抗蛋白酶消化特性 是TSE的致病因子 PrPsc经蛋白酶消化后剩下的核心部分分子量约27 30kD 称PrP27 30 仍具感染性 PrPC是一种膜蛋白 分子量33 35kD N端含有22个残基的信号肽序列 C端含有1对二硫键和2个N型复合寡糖链 以及1个糖基磷脂酰肌醇 GPI 结合位点 糖基化的人PrPC蛋白模型 两个N 连接的寡糖 蓝色 一个二硫键连接螺旋2和3 和糖基磷脂酰肌醇 GPI 的 锚 它将蛋白锚定在细胞膜外表面 PrPc与PrPsc具有相同的氨基酸顺序和共价修饰 但三维结构却差异很大 傅里叶变换红外光谱和圆二色谱研究表明 PrPc主要由 螺旋构成 PrPsc则含有40 的 折叠 血清学研究表明 特异的抗体只与PrpSC有血清反应 而与PrpC无反应 朊病毒的结构与功能 根据傅里叶变换红外光谱 FTIR 和圆二色谱 CD 的研究 PrPC和PrPSC的二级结构差异很大 PrPC中含43 的a螺旋 而PrPSC中含有30 的a螺旋和43 的b片层 对PrPSC的免疫原性分析表明 构象的变化主要发生在90 145或175的残基区域 目前已获得鼠 羊 人和牛全长PrPC的NMR结构 不同种属的PrPC的结构都很类似 PrPSC是纤维状的多聚体 在非变性溶液中是不溶解的 目前还没有实验结构 不溶性的PrPSC形成的纤维状聚集体 酵母Sup35蛋白 酵母细胞中的prion蛋白 形成的纤维的电子显微像 右侧是一根放大的纤维 小鼠PrPCC端结构域 121 231 的NMR结构 包括三个 螺旋和两股反平行 折叠 其中两个 螺旋 螺旋2和3 通过一个二硫键锚定在一起组成V形骨架 另一个a螺旋 螺旋1 和2条b折叠链附着在此骨架上 用分子模拟方法预测的PrPSC的结构 推测