动物细胞融合与单克隆抗体用PPT课件.ppt

专题2细胞工程动物细胞融合与单克隆抗体 1 2002年12月30日 两场筹备了10年的 太空婚礼 首次在神舟四号飞船上举行 植物细胞 新人 黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体 动物细胞 新人 是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞 两批新人同时在 产房 电融合仪内孕育新生命 太空婚礼 这两场 太空婚礼 实质是哪两项细胞工程技术 植物体细胞杂交技术 动物细胞融合技术 2 知识回顾 再分化 一 原理 细胞膜具有流动性细胞的全能性 二 诱导方法 电刺激 聚乙二醇 三 用途 获得杂种植株 脱分化 3 A细胞 B细胞 人工诱导 1 1动物细胞融合的概念 杂交细胞 动物细胞融合 也称细胞杂交 是指两个或多个细胞融合形成一个单核细胞的过程 一 动物细胞融合 4 阅读课本P52及识图2 23 并完成学案第1页 学习过程 5 细胞膜的流动性 灭活病毒 PEG 电激等 融合后的细胞进行有丝分裂 形成完整的杂交细胞 诱导的手段 融合后细胞的类型 AB杂种细胞遗传物质有什么特点 三种AA AB BB A B 含两种生物的遗传物质 1 2动物细胞融合过程 原理 6 1 2动物细胞融合过程 为什么灭活的病毒能作诱导剂 灭活丧失感染性 保留融合活性 7 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合 形成杂交细胞 细胞膜具有一定的流动性 8 1 3动物细胞融合技术的意义和应用 9 1 4比较动 植物细胞杂交技术 10 例1 能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 A 离心B 灭活的病毒C 电刺激D 振动 例2 融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点 具有原来两个或多个细胞的遗传信息B 能无限增殖C 可形成新个体D 培养过程会贴壁 例3 动物细胞融合的作用中最重要的是 A 克服远源杂交不亲和B 制备单克隆抗体C 培育新物种D 生产杂种细胞 B B 初试牛刀 A 11 强调 效应B淋巴细胞是能够产生抗体的B淋巴细胞 下文将其简称为B淋巴细胞 抗体 能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 能产生抗体的细胞是浆细胞 即效应B细胞 温故知新 二 单克隆抗体 B淋巴细胞 效应B淋巴细胞 记忆B淋巴细胞 分化 12 抗体的传统生产方法 抗原 反复注射动物 从动物的血清中分离抗体 该法制备抗体的缺点 产量低 纯度低 且抗体的特异性差 灵敏度低 如何解决这个问题呢 单克隆抗体 13 14 15 人们发现 在动物发生免疫反应的过程中 体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体 但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体 要想获得大量的单一抗体 必须克隆单一的B淋巴细胞 形成细胞群 请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念 用单个B淋巴细胞进行 无性繁殖 克隆 得到的基因型相同的细胞群能够分泌一种化学性质单一 特异性强的抗体 这种抗体就叫做单克隆抗体 2 1单克隆抗体的概念 16 单克隆抗体的特点 人们发现 在动物发生免疫反应的过程中 体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体 但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一 特异性强的抗体 要想获得大量的单一抗体 必须用单个B细胞进行无性繁殖 即克隆 单克隆抗体 单个B细胞克隆产生的化学性质单一 特异性强的抗体 17 思考 1 在体外培养的条件下 一个B淋巴细胞有没有可能无限增殖 不可能 2 我们学过的什么细胞具有这样的能力 癌细胞 3 有什么办法让B淋巴细胞也具有这样的能力 细胞融合 18 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞 癌细胞 能无限增殖 杂种细胞 动物细胞培养技术 实验原理 动物细胞融合 创始人 米尔斯坦 单克隆抗体 既能产生特异性抗体 又能大量繁殖 柯勒 19 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞能无限增殖 杂交瘤细胞 动物细胞培养技术 设计方案 动物细胞融合技术 单克隆抗体 既能产生特异性抗体 又能大量增殖的细胞 1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验 20 BB B瘤 瘤瘤 B 瘤 一选 选择性培养基 只有杂交瘤细胞才能存活 获得产生相应抗体的B细胞 二选 选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞 体外培养 小鼠腹腔内培养 杂交瘤细胞特点 既能产生特异性抗体 又能大量增殖 21 3 过程 免疫动物 灭活的仙台病毒 种 BB B瘤 瘤瘤 杂交细胞 免疫B细胞和骨髓瘤细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选 分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 单克隆抗体的大量制备 22 克隆化培养筛选 多孔细胞培养板专一抗体阳性检测 23 4 如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养 融合后的细胞经选择性培养基培养后 能存活的细胞就是杂交瘤细胞 但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞 通常用 有限稀释法 来选择 将杂交瘤细胞稀释 用多孔细胞培养板培养 使每孔细胞不超过一个 通过培养让其增殖 然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 常用酶联免疫吸附试验法 那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞 挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释 一般需进行3 4次 直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞 该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养 24 在多孔培养板上 在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下 培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的 所以产生的抗体必然是化学性质单一的 特异性强的单克隆抗体 这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义 只不过克隆的不是B淋巴细胞 而是杂交瘤细胞 杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖 又能产生专一抗体 25 26 过程 抗原 小鼠 效应B细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞融合 筛选 多孔培养板单个细胞培养 筛选 能产生特定抗体的细胞群 体外培养体内培养 提取出单克隆抗体 27 28 单抗制备过程分哪几步 请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来 顺序是 你学会了吗 29 思考与探究 1 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同 不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁 然后再融合 动物细胞融合是两个体细胞直接融合 诱导融合方法不同 动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导 结果不同 植物体细胞杂交培养成了杂种植株 而动物细胞融合只培养出了杂交细胞 30 2 制备单克隆抗体时 为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞 哺乳动物感染抗原后 其体内会形成相应的B淋巴细胞 B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原 动物在免疫反应的过程中 每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体 要想获得大量的特异性抗体 必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖 B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力 但不能在体外增殖 骨髓瘤细胞是一种癌细胞 它能在体外培养条件下无限增殖 但不能产生抗体 因此 把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合 产生杂交瘤细胞 它会兼有两个亲本细胞的特性 在体外培养条件下能不断增殖 同时能产生出某种特异性的抗体 31 3 为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合 就目前常用的细胞融合方法来看 不管是用物理的 化学的方法 还是生物的方法 其融合率都不可能是100 仅用两个细胞融合 其效率太低 不一定能得到融合细胞 更重要的是 即使两个细胞已发生融合 但并不一定是研究者期望得到的细胞类型 目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备 我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题 我们知道 体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上 但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 如果仅取一个脾细胞 含B淋巴细胞 和一个瘤细胞杂交 我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的 若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合 就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 32 知识拓展 6 单倍体的诱导方法及应用价值 单倍体 haploid 是指具有配子染色体数目的个体 单倍体可以自发产生 也可以诱发产生 动物中 除蜜蜂 白蚁等外 的单倍体 由于生理上不正常 在胚胎发育时期就会死亡 植物上自发产生单倍体的植物很多 如番茄 棉花 咖啡 甜菜 大麦 小麦 油菜等 共有约10个科26个属36个种的植物可以自发产生单倍体 除了自发产生单倍体外 人工诱导产生单倍体的方法有 1 种间和属间杂交 由于远缘杂交 虽然不能受精 但在远缘物种的花粉诱导下 卵细胞可以在未受精情况下发育成胚 这种情况在马铃薯 大麦 小麦 玉米中都可以发生 2 物理和化学诱变 花粉经射线照射或化学药品处理失去受精能力 但仍可以刺激卵细胞发育成胚 3 双生苗筛选 有些植物可以产生多胚种子 即2 3个胚共处于一个种皮中 这样的种子可以形成单倍体植株 4 花药或花粉培养 单倍体具有很好的应用价值 在植物育种上 单倍体经过加倍可以使后代迅速纯合 缩短育种年限 由于单倍体经加倍后 在理论上各基因位点应处于纯合状态 对后代进行选择时 选择到的个体代表着真实的变异 避免了杂交育种中杂交优势对选择个体的干扰 提高了选择效率 用单倍体作为转基因的受体 获得的转基因材料经加倍后基因即可纯合 避免了体细胞作为受体 会由于后代分离需要多代选择的麻烦 目前以油菜小孢子作为转基因受体已得到转基因植株 33 2 3单克隆抗体的应用 诊断试剂 最广泛应用准确 高效 简易 快速 单克隆抗体最主要的优点 特异性强 灵敏度高 并能大量制备 34 生物导弹 单克隆抗体 药物单抗导向 药物为弹头 治疗疾病和运载药物 主要用于治疗癌症治疗 单克隆抗体作为载体 运载抗癌药物 形成 生物导弹 准确杀伤癌变细胞 35 36 两个过程 动物细胞培养过程 单克隆抗体制备过程 三个 一 一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒 一个新细胞 杂交瘤细胞 一个优势 单克隆抗体特异性强 灵敏度高的优势 本节小结 重点 37 例4 科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合 得到杂交细胞 经培养可产生大量的单克隆抗体 与骨髓瘤细胞融合的是 A 经过免疫的B淋巴细胞C 经过免疫的T淋巴细胞B 不经过免疫的T淋巴细胞D 不经过免疫的B淋巴细胞 例5 单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 B淋巴细胞B T淋巴细胞C 骨髓瘤细胞D 杂交瘤细胞 A 初试牛刀 D 38 例6 用动物细胞工程技术获取单克隆抗体 下列实验步骤中错误的是 A 将抗原注入小鼠体内 获得能产生抗体的B淋巴细胞B 用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C 用聚乙二醇作诱导剂 促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D 筛选杂交细胞 并从中选出能产生所需抗体的细胞群 培养后提取单克隆抗体 B 初试牛刀 39 练习 1 动物细胞融合和植物原生质体融合比较 在动物细胞融合中有特殊性的是 A 融合的原理B 融合的优点C 融合的诱导手段D 融合的过程 40 练习 2 动物细胞融合的目的中最重要的是 A 克服远缘杂交不亲和B 制备单克隆抗体C 培育新物种D 生产杂种细胞 41 练习 3 科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合 得到杂交细胞 经培养可产生大量的单克隆抗体 与骨髓瘤细胞融合的是 A 经过免疫的B淋巴细胞B 不经过免疫的T淋巴细胞C 经过免疫的T淋巴细胞D 不经过免疫的B淋巴细胞 42 练习 4 单克隆抗体制备过程中 骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后 要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞A B C D 43 练习 5 研究单克隆抗体治疗癌症的思路是 A 利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞B 以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C 抗癌物质在克隆细胞中大量合成D 单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合 44 练习 6 只能使动物细胞融合的常用诱导方法 A PEGB 灭活的病毒C 电刺激D 离心7 生物导弹 是指 A 单克隆抗体B 杂交瘤细胞C 产生特定抗体的B淋巴细胞D 在单抗上连接抗癌药物 45 练习 8 下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中 不正确的是 A B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合 一般不需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导B 融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖 又能产生单克隆抗体C 体外培养时 一个效应B淋巴细胞可以产生抗体 但不能无限增殖D 单克隆抗体与常规抗体相比 特异性强 灵敏度高 优越性明显 A 46 9 单克隆抗体制备过程中 骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后 要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞A B C D C 47 1 若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞 则B细胞是取自小鼠体内的细胞 从小鼠体内提取分离该细胞之前 应给小鼠注射 类物质 2 d过程是一个 过程 该过程的进行常用 或 的诱导 3 假设仅考虑某两个细胞的融合 则可形成种类型的C细胞 因此需用 培养基筛选出D细胞用于培养 D细胞的名称是 其特点是 效应B 抗原 细胞融合 聚乙二醇灭活的病毒 选择性 3 既能无限增殖又能产生特异性抗体 杂交瘤细胞 48 4 在培养时通过 分裂方式大量繁殖 D细胞体外培养需要注意的条件是 要求答5项 5 单克隆抗体在疾病的诊断 治疗和预防方面 与常规抗体相比 其特点是 特异性强 灵敏度高 有丝 无菌 无毒的环境 充足的营养 适宜的温度和pH 适宜的气体环境 49 11 1 单克隆抗体是指 2 制备单克隆抗体的步骤 将 注入小鼠体内 从小鼠脾脏中获得淋巴细胞 其中至少1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体 将步骤 获得的B淋巴细胞与步骤 培养的骨髓瘤细胞在 的诱导下融合 将诱导后产生的多种细胞 放在 培养基的多孔培养板上培养 筛选