Chemerin及CMKLRmRNA在高脂膳食大鼠肝脏中的表达及有氧运动干预.doc

SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目 Chemerin/CMKLR1-mRNA在高脂膳食大鼠肝脏中的表达及有氧运动干预研究生姓名丁锐指导教师姓名吴明方专业名称运动人体科学研究方向体育保健与康复论文提交日期2014年3月15日41 / 49中文摘要研究目的：采用动物实验法，通过对高脂膳食大鼠运动与安静的不同状态下肝脏组织Chemerin/CMKLR1-mRNA表达水平及其血浆TNF-、MCP-1水平变化的比较与分析，探讨高脂膳食对大鼠肝脏功能的影响以及运动抗炎作用和对高脂膳食大鼠肝脏的保护作用。研究方法：健康清洁雄性8周龄SD大鼠40只，适应性喂养1周后随机分为普通膳食不运动组(N=10，C）、高脂膳食不运动组(N=10，H）、普通饲料运动组（N=10，CE）、高脂饲料运动组（N=10，HE）。每周测量大鼠体重。运动组大鼠进行1周适应性跑台运动后，进行6周有氧运动，采用0坡度跑台，20m/min速度进行，每周增加1m/min，1次/d，40-50min/次，6天/每周，每天运动时间：21:00-24:00。第6周末，各组禁食12小时后，大鼠尾静脉取血测空腹血糖，心尖采血分离血浆经3000rpm离心30min后取上清液置于冻存管-80冰箱中储存待测，迅速摘取肝脏，分别放入液氮和福尔马林液保存待用。ELISA法测血浆细胞因子TNF-、MCP-1、胰岛素（Fins）；PCR技术检测CMKLR1-mRNA；Western blot技术检测Chemerin蛋白；大鼠肝脏组织切片HE染色观察KCs浸润。运用SPSS11.5软件处理所获数据。结 果：1.各组大鼠体重在实验过程中均呈增长趋势。H组大鼠体重与C组、HE组和CE组比较增长明显（P0.01、P0.05）。2.高脂膳食可以明显增加大鼠血浆TNF-、MCP-1水平（P0.01）；有氧运动可以明显降低高脂膳食大鼠血浆TNF-、MCP-1水平（P0.05）；有氧运动和高脂膳食无交互作用（P0.05）；3.大鼠肝脏组织HE染色可见，H组与C组比较出现弥漫性、小泡样脂肪变，可见库普弗细胞浸润；HE组与H组比较小泡样脂肪变程度降低；高脂膳食可使大鼠肝脏CMKLRmRNA/Chemerin表达水平明显升高（P0.01），有氧运动可使高脂膳食大鼠肝脏CMKLRmRNA/Chemerin表达水平降低（P0.05），有氧运动和高脂膳食无交互作用（P0.05）。结 论：1. 6周高脂膳食使大鼠体重增加明显，血浆TNF-、MCP-1水平、Homa-IR升高，导致大鼠肥胖、体内发生炎性反应和IR。 2. 6周高脂膳食使大鼠肝细胞脂肪变性、KCs浸润、Chemerin/CMKLR1-mRNA表达水平明显升高，诱导大鼠肝脏内炎性反应。3. 6周有氧运动对高脂膳食大鼠具有控制体重，减轻肥胖，改善胰岛素抵抗的良好作用，并可降低肝脏Chemerin/CMKLR1-mRNA的表达水平，在一定程度上减轻肝脏炎性反应，逆转肝脏的脂肪变性，具有保护肝脏的作用。关键词：有氧运动 高脂膳食 MCP-1 Chemerin/CMKLR1-mRNA作者：丁锐指导教师：吴明方Chemerin/CMKLR1-mRNA expression in liver of rats with high-fat diet and effect of aerobic exerise on itAbstractPurpose：Animal experiments using the method, by comparison with the analysis of the expression of liver tissue ChemerinmRNA/CMKLR1-mRNA movement fat diet rats under different states with a quiet level and TNF-、MCP-1 levels change, explore the effect of high fat diet and exercise anti-inflammatory effects on liver function in rats and the protective effect of dietary fat rat liver.Methods：Healthy 8-week-old male SD rats Clean 40, one week after the adaptive feeding randomly divided into normal diet does not even exercise group (N = 10, C）, high-fat diet without exercise group (N = 10, H）, normal diet exercise group (N = 10, CE）, high-fat diet exercise group (N = 10, HE）, C/CE group with normal diet routine feeding, H/HE group of high-fat diet feeding .Weekly measurements of body weight, height. Motion adaptive rats for 1 week after treadmill exercise, aerobic exercise performed 4-6 weeks, using 0 slope treadmill speed 20m/min be increased 1m/min week, 1 / d, 40 - 50min / times, 6 days / week exercise time each day :21:00-24: 00.The first 6 weeks, the groups were fasted for 12 hours, the rat tail vein blood fasting glucose, blood plasma was separated after the apex 30min and the supernatant was centrifuged at 3000rpm placed in vials stored at -80 tested quickly removal of the liver, were placed in liquid nitrogen and stored in formalin for later use. ELISA method to measure plasma cytokines TNF-, insulin (Fins）; using PCR technology to detect CMKLR1-mRNA; Western blot technique to detect Chemerin;HE staining of liver tissue infiltration observed KCs. Test using SPSS11.5 software processing the data obtained.Result: 1. Body weight of rats in each group are a growing trend in the course of the experiment. The rats in group H and group C, weight HE and CE groupincreased significantly (P 0.01, P 0.05）;2.Through single factor analysis of variance, high fat diet can significantly increase the plasma TNF- 、MCP-1 levels in rats (P 0.01); aerobic exercise can obviously decrease the plasma levels of TNF- 、MCP-1 in rats fed a high fat diet (P 0.05)；3. Rat liver tissue HE staining, H group compared with C group appeared diffuse, vesicle like fatty change, visible Kupffer cell infiltration; in group HEcompared with group H vesicle like steatosis degree reduction;High fat diet can make the liver CMKLRmRNA/Chemerin level of rats increased significantly(P 0.01）,aerobic exercise can reduce the level of CMKLRmRNA/Chemerin in liver of rats fed a high fat diet(P 0.05）,aerobic exercise and high fat diet no interaction(P 0.05）;Conclusions：1. 6 weeks of high fat diet the weight of rats increased significantly, plasma levels of TNF- , MCP-1, Homa-IR increased, leading to obesity in rats in vivo, inflammation and IR.2. 6 weeks of high fat diet rats, fatty degeneration of hepatocytes, infiltration of KCs, Chemerin/CMKLR1-mRNA expression level increased, induced inflammation in rat liver.3. 6 weeks aerobic exercise with weight control, on the high fat diet rat reduce weight, improve insulin resistance good effect, and can reduce theexpression level of Chemerin/CMKLR1-mRNA in the liver of hepatic inflammation, alleviate to some extent, the reversal of hepatic steatosis,which has the function of protecting liver.Key words:Aerobic exercise ; fat diet ; MCP-1 ;Chemerin/CMKLR1-mRNAWritten by :Ding ruiSupervised by: Wu Mingfang目 录1 引言11.1选题依据11.2文献综述21.2.1肝脏炎性反应21.2.2趋化素及其受体生物学功能51.2.3库普弗细胞及其在肝脏炎性反应中的作用71.2.4其它相关炎症因子81.2.5运动对肝脏炎性反应的影响112 实验对象与方法142.1实验对象142.2实验方法142.2.1大鼠喂养142.2.2大鼠分组及运动干预142.2.3血样采集与取材152.3测试指标及测试方法152.3.1体重：用电子秤测量体重。152.3.2血糖（FPG）：152.3.3血浆胰岛素、TNF-、MCP-1152.3.4大鼠肝脏病理切片的制备及染色162.3.5 RT-PCR法检测大鼠肝脏CMKLR1-mRNA162.3.6 Western blot检测Chemerin蛋白192.4实验仪器及材料192.5数据统计分析203 实验结果213.1实验过程中大鼠体重的变化(见图1）213.2各组大鼠FPG及血浆FINS、Homa-IR的变化(见表3）213.3各组大鼠血浆TNF-、MPC-1水平的变化（见表4）223.4各组大鼠肝脏CMKLR1-mRNA表达水平的变化233.4.1 RT-PCR分析CMKLR1-mRNA在四组大鼠肝脏组织中的表达233.5各组大鼠肝脏Chemerin蛋白表达水平的变化243.6各组大鼠肝脏组织病理切片（图7）254 分析讨论284.1高脂膳食大鼠血浆TNF-、MCP-1水平及Homa-IR变化及有氧运动干预作用284.2高脂膳食大鼠肝脏脂肪细胞变性、KCs浸润及有氧运动干预作用284.3高脂膳食大鼠肝脏Chemerin/CMKLR1-mRNA水平的变化及运动干预作用295 结论316 参考文献327 攻读硕士期间公开发表论文418 致谢421引 言1.1选题依据研究证实，体内脂肪堆积尤其是内脏脂肪堆积，是导致肝脏炎性反应以及肝脏相关代谢性疾病的危险因素；而高脂膳食、久坐少动等不良生活习惯则是其重要诱因之一。越来越多的研究认为，脂肪不仅是内分泌器官，还是胰岛素抵抗产生的始发部位，尤其是内脏脂肪如肝脏内脂肪及其炎性反应状态，在胰岛素抵抗和代谢综合征发生、发展过程中起着非常重要作用，是导致非酒精性脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病的重要病理机制之一。 的依据、意义。其丝氨酸和苏氨酸磷酸化，并使之肝脏趋化素（Chemerin）是一种新发现的脂肪细胞因子，由脂肪细胞分泌，通过自分泌或旁分泌途径作用于自身受体(ChemerinR）。正常生理状态下，由脂肪、肝脏、脾、肺等组织不断产生的Pro-chemerin是Chemerin低活性的前体蛋白，在体内发挥免疫监视作用；而在炎症早期，脂肪组织分泌的多种蛋白酶能够水解prochem-erin，使之活化为Chemerin。研究显示，脂肪组织不仅是Chemerin的分泌器官同时也是它的靶器官。ChemerinR则是一种主要分布在人体肝、脾等组织的G蛋白偶联受体，被命名为趋化因子受体-1(CMKLRl）。作为一种脂肪因子，Chemerin/CMKLR1在调节脂肪细胞代谢以及增强胰岛素信号转导，促进胰岛素刺激的葡萄糖转运等方面具有重要作用；而作为一种炎症因子，Chemerin/CMKLR1可通过多种途径和机制参与IR发生和发展。最近发现，肥胖时由肝脏组织分泌的Chemerin可以通过与肝脏库普弗细胞表面受体CMKLRl结合，诱发和加剧肝内的炎性反应，并参与肝脏胰岛素抵抗的发生、发展。库普弗细胞（Kupffer cell，KCs），即肝脏中特殊的巨噬细胞，是单核吞噬细胞系统的一部分。当Chemerin分泌增加并与表达在KCs表面的CMKLRl结合时，可激活并趋化KCs，导致肝脏KCs浸润，并释放肿瘤坏死因子TNF-、白细胞介素IL-1、IL-6等炎性因子，诱导和扩大肝脏内炎性反应。鉴于此，本研究从肝脏炎性反应的角度，通过对高脂膳食大鼠运动与安静的不同状态下肝脏组织Chemerin/CMKLR1-mRNA表达水平及其TNF-水平变化的比较与分析，探讨运动对高脂膳食大鼠肝脏的保护作用，以利于提高代谢性疾病的防治水平。1.2文献综述1.2.1肝脏炎性反应1.2.1.1肝脏炎性反应的研究现状研究显示1，因高脂饮食、营养过剩等引发的糖脂代谢紊乱、腹型肥胖、高血压、糖尿病等一系列代谢性疾病，除了其本身存在内分泌及代谢功能的紊乱外，同时还伴有体内炎性反应。过强的炎性反应可使大量炎性介质进入血循环造成全身炎性反应综合征(SIRS），肝脏炎性反应则是全身炎性反应综合征的一个脏器表现。肝脏是体内最大的内分泌腺体，是机体重要的代谢器官，是维持血糖稳定，消除氨、乳酸等代谢产物的重要场所，以及维持机体的免疫防御、血液凝固等多重功能的重要器官，对于维持人体机能具有重要意义2。肝脏炎性反应及其相关的肝脏临床事件将导致肝功能的严重受损。有学者在代谢性疾病相关炎性反应的机制研究观察发现3，肝脏脂肪组织内存在炎症细胞的聚集及炎症因子的过度表达。有关炎症细胞在肝脏脂肪组织中的聚集研究表明4，正常脂肪组织中存在的巨噬细胞为脂肪组织重塑及前脂肪细胞成脂的需要，产生了许多血管生成因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子-和肝细胞生长因子等，以利于脂肪组织扩增。在肥胖症患者体内，能量物质过度积累引起肝脏脂肪细胞体积变大、代谢活跃、氧需求增加，常导致脂肪组织氧供不足及氧利用障碍5，最终使肝脏脂肪细胞膜内外离子分布失衡、膜稳定性及能量代谢异常、细胞坏死增加。为清除这些坏死组织，肝脏脂肪组织内出现单核巨噬细胞及中性粒细胞聚集；同时局部缺氧引起的氧化应激也可直接刺激肝脏脂肪细胞过度生成，从而促进单核巨噬细胞的聚集、释放大量炎症因子，进一步诱发肝脏脂肪组织内发生过度的炎性反应。肝脏脂肪组织及其炎性反应状态在胰岛素抵抗和代谢综合征发生、发展过程中起着非常重要作用，是导致非酒精性脂肪肝以及高血压、高脂血症、动脉粥样硬化等疾病的重要病理机制之一。研究发现6，肝脏炎性反应时释放出的大量炎症因子如TNF-等，可促进非酒精性脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗的形成；Dandona等7提出，营养过剩(饮食中含大量糖、奶油等快餐食品）可诱发氧化应激和肝脏炎性反应，导致胰岛素抵抗（IR）和代谢综合征（MS）；刘兰等8则通过探讨脂肪肝中肝脏炎症与动脉粥样硬化病变的关系发现，肝脏炎性反应时合成分泌的炎症因子CRP 与动脉粥样硬化病变程度及面积有关，并参与肝脏炎症促发动脉粥样硬化的发病。1.2.1.2高脂膳食与肝脏炎性反应饮食因素是影响肝脏功能的重要环境因素之一，不同的饮食结构对肝脏相关疾病的发生发展可起到保护或促进作用9。流行病学研究表明7，脂类、高糖饮料的过量摄入与肝脏相关疾病的发病密切相关。长期的高脂膳食可导致体内能量物质增加、脂肪积累，特别是腹部内脏器官脂肪堆积，使肝脏器官组织内部出现能量代谢紊乱，循环中游离脂肪酸浓度增加，其中游离饱和脂肪酸可以直接刺激血管内皮细胞产生前炎性反应，即“脂毒性(1ipotoxicity）”作用10。“脂毒性”理论11-13认为：机体游离脂肪酸(free fatty acids，FFA）不仅是细胞代谢的重要能量来源，而且是一种内分泌介质，在调节糖脂代谢和胰岛素敏感性等方面发挥着重要作用，最终可导致IR14。对此，“门静脉学说”指出15，内脏脂肪分解形成FFA能力明显高于其他部位的脂肪组织，内脏甘油三酯（TG）储存增加时，经过门静脉送到肝脏的FFA增加。此时，大量FFA就会从脂肪细胞溢出，异常增多的FFA因此产生“脂毒性”作用：一方面循环中FFA升高使脂质过度沉积，导致脂肪细胞体积增大伴有数目增多；另一方面刺激过度堆积的脂肪组织释放大量的肿瘤坏死因子(TNF-）、白细胞介素-6(IL-6）、单核巨噬细胞趋化蛋白(MCP-1）等炎症因子，这些炎症因子与脂肪组织及其他组织细胞的细胞因子受体和模式识别受体相结合，干扰机体的糖、脂正常代谢，造成机体主要代谢器官长期处于低度炎症状态，机体胰岛素敏感性降低，形成以IR为主要特征的糖、脂代谢紊乱状态，发生以肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、高血脂症、冠心病等聚集倾向的代谢综合征。流行病学资料和实验研究结果提示16：长期高脂饮食人群的胰岛素抵抗及其并发症明显高于正常人群，高脂环境可以降低包括骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。既往有研究发现17-18，高脂喂养后的大鼠可诱导其发生肝内脂质沉积和肝脏胰岛素抵抗，同时伴有各种肝细胞内其他临床事件的发生，如线粒体脂肪酸氧化功能障碍、脂质合成增加、内质网应激以及炎性反应通路激活等。丁晓东19等予以SD大鼠8周高脂饮食(2胆固醇+10%猪油+88标准饲料）复制非酒精性脂肪肝模型后在光镜下观察发现，大鼠肝脏呈弥漫性脂肪变性，以肝腺泡区最为明显，87,5达脂肪肝诊断标准，41.7肝脏小叶内出现轻度炎症细胞浸润和散在的点状坏死，几乎所有大鼠均可见到小叶内炎症，炎症细胞以单核细胞为主，伴点状和或小灶性坏死，部分标本见数个炎症坏死灶融合成片，汇管区亦可见到以单个核细胞为主的炎症细胞浸润；张海峰20等通过高脂饮食诱导SD大鼠非酒精性脂肪肝，光镜下观察到高脂组大鼠肝腺泡结构紊乱，肝板排列不整齐，肝窦间隙变窄，所有标本均出现小叶内炎症细胞浸润，大部分出现汇管区炎症，有些标本出现点状坏死甚至片状坏死，少数出现碎屑样坏死，炎症细胞以单核细胞和淋巴细胞为主，也有一些中性粒细胞浸润。柳红芳21等采用饱和脂肪酸制成的高脂饲料喂养雄性Wistar大鼠，高脂组大鼠体重明显增加，糖耐量和胰岛素耐量下降，胰岛素抵抗指数、空腹血糖、血清胰岛素、血清瘦素、血清胆固醇、甘油三酯、炎症因子TNF-含量均明显升高。研究表明，“脂毒性”与肝脏胰岛素抵抗也有关。Leeuw22等用高脂饲料喂养C57BL6小鼠，在喂养4周后即出现肝脏胰岛素抵抗；Neha23等的研究结果发现高脂饮食可致使实验鼠出现糖耐量下降、体重增加等胰岛素抵抗特征，喂养高脂饲料5周后，高脂组实验动物血糖、血胰岛素和血脂水平明显高于对照组；Wasana24等研究发现在喂养高脂饲料4周后，高脂组Wistar雄鼠体重明显增加，肾上腺皮质激素明显上升，并导致周围胰岛素抵抗的发生。从第8周开始，高脂组鼠腹内脂肪、血糖、血胰岛素和甘油三酯明显高于对照组，胰岛素抵抗进一步恶化25。肝脏胰岛素信号通路发生的障碍，在营养过剩所致的全身胰岛素抵抗中起着重要的作用26。Jaya27等的研究显示高脂高糖饲料能诱导Wistar雄鼠产生胰岛素抵抗和肝脏脂肪的积累而形成脂肪肝；Tomonori28等的研究也发现高脂饮食能造成肝脏胰岛素抵抗，但可以通过降低固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1C）的表达来缓解胰岛素抵抗的病态；李岚29等通过高脂饮食喂养雄性SD大鼠，实验中发现胰岛素抵抗与喂养时间及肝脏脂肪变性程度呈正相关；陈世清30用高脂饲料成功地建立脂肪肝胰岛素抵抗大鼠模型，结果表明饮食中的脂肪含量可明显影响脂肪肝大鼠模型的胰岛素抵抗。进一步研究还发现31，炎性细胞浸润、脱颗粒以及释放组织蛋白酶G等，可使趋化素前体（prochemerin）转变为活性趋化素（Chemerin），Chemerin可通过与巨噬细胞表面表达的Chemerin受体结合，从而趋化巨噬细胞，即肝内库普弗细胞（KCs）。KCs是非酒精性脂肪肝氧自由基的重要来源，可释放过氧化氢、一氧化氮(NO），募集中性粒细胞和淋巴细胞等炎性反应细胞，使之在肝内聚集，诱发或加剧肝内的炎性反应32。同时激活KCs，使之释放炎性反应因子TNF-、IL-1、IL-6，进一步促进和扩大肝内炎性反应。其中，TNF-对肝细胞还有直接损伤作用33。1.2.2趋化素及其受体生物学功能1.2.2.1概述趋化素（Chemerin）是一种由脂肪细胞分泌的促炎症趋化因子，2007年Boza Dglu等34用信号序列捕获技术首次在炎症体液及肾衰竭患者血液滤过液中发现。人类Chemerin蛋白质以无活性的前体形式(prochemerin）分泌和释放，被凝血、纤溶和炎性因子激活后，使其成为具有生物活性的Chemerin，从而获得趋化活性31。Chemerin在不同物种组织的表达略有不同，在人体脂肪组织、肾上腺、肝脏、肺、胰腺、胎盘、卵巢、皮肤等都有表达，其中主要表达于脂肪组织、肝脏和肺，具有调节脂肪细胞分化、脂解，促进脂肪细胞内胰岛素信号传导途径，调节天然及获得性免疫反应，以及调节骨骼的发育和代谢，维持皮肤正常生理功能等多种生物学效应，是一种重要的生理调节肽。Zabel35等采用实时RT-PCR发现，ChemerinmRNA在肝脏、胰腺、皮肤、肺、脑垂体、卵巢、脂肪等组织都有表达，但未发现在外周血自细胞中表达。其中，肝脏是血浆中Chemerin一个主要的来源。Chemerin受体(Chemerin R）最早由Gantz等人36先于Chemerin被发现，是一种主要分布于人体肝、脾等组织的G蛋白偶联受体，被命名为趋化因子受体1(CMKLRl），在人类也被称为ChemR23。Chemerin有3种受体：Chemerin受体l(CMKLR1）、肥大细胞表面趋化因子受体2(CCRL2）以及GPcRs家族成员GPRl。Chemerin主要通过自分泌或旁分泌途径作用于CMKLR1实现其生物学功能，如参与炎性反应、调节糖脂代谢等。而Chemerin与CCRL2结合，并不产生细胞内效应，推测可能是通过募集Chemerin，提高局部Chemerin浓度，促进与CMKLRl作用37。CMKLR1主要表达于人体肝脏、脂肪组织、单核细胞源性巨噬细胞、未成熟树突状细胞。1.2.2.2在炎性反应中的作用Chemerin/CMKLR1可募集树突状细胞和巨噬细胞向炎症部位迁移，并通过多种途径增加炎症因子分泌介导炎性反应38-40。在炎症早期，炎性细胞浸润、多形核细胞脱颗粒，释放组织蛋白酶G和弹性蛋白酶，这些丝氨酸蛋白酶使prochemerin转变为活性Chemerin；然后Chemerin募集携有CMKLR1的细胞，包括未成熟树突状细胞和巨噬细胞，在始动免疫应答方面起着重要作用。所以认为Chemerin产生于炎症的早期阶段，在天然性免疫与适应性免疫之间起着桥梁作用，是天然性免疫与适应性免疫的重要联系41。作为趋化因子，Chemerin募集表达有CMKLRl的单核细胞源性巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞，向炎性反应部位聚集，实现对局部炎性反应的免疫应答。Chemerin通过其受体CMKLRl发挥对专职抗原提呈细胞(树突状细胞和巨噬细胞）的募集和迁移作用，参与组织免疫和炎症应答。CMKLRl高表达于未成熟的树突状细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞中，在自然杀伤(NK）细胞和淋巴细胞中也有表达。研究还显示39，Chemerin/CMKLR1系统在炎症或损伤组织有趋化抗原呈递细胞(APC）和NK细胞聚集的作用。Chemerin通过与CMKLR1结合募集APC如未成熟的树突状细胞和巨噬细胞等，这些APC细胞除了吞噬作用外还能释放大量炎症因子如肿瘤坏死因子，白介素-6，C反应蛋白等炎症因子，进一步介导和扩大炎性反应。Zabel等35研究提示，促炎性反应因子和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR）配体可以抑制巨噬细胞表达CMKLR1，而转化生长因子-（transforming growth factor-,TGF-）、炎症因子可上调单核细胞CMKLR1的表达水平。1.2.2.3 在胰岛素抵抗形成中的作用胰岛素抵抗(IR)是指胰岛素作用的靶组织(主要是肝脏、肌肉和脂肪组织)对胰岛素作用的敏感性降低。肝脏是胰岛素抵抗的重要场所，研究chemerin对肝组织胰岛素敏感性的影响尤为重要。肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出(HGP)的能力下降，HGP主要是由糖异生(GNG)和糖原分解(GL)两部分组成。维持空腹状态下的内生性糖的产生和输出及进食后糖的吸收、利用和存储。高脂饮食结构特别是高饱和、反式脂肪酸的摄入在胰岛素抵抗发病中起重要作用，特别是内脏型肥胖与胰岛素抵抗密切相关。新的脂肪因子Chemerin在脂代谢、炎症、胰岛素抵抗中起重要作用。Chemerin通过与巨噬细胞表面表达的CMKLR1结合，趋化巨噬细胞，而巨噬细胞定居在肝内即为KCs。KC是非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）氧自由基的重要来源细胞，可释放过氧化氢、一氧化氮(NO），募集中性粒细胞和淋巴细胞等炎性反应细胞，使之在肝内聚集，诱发或加剧肝内的炎性反应42。Chemerin在参与肝脏炎性反应的同时激活KCs，使之释放炎性反应因子TNF-、IL-1、IL-6，抑制胰岛素受体底物-1丝氨酸磷酸化，进而抑制胰岛素受体酪氨酸磷酸化，导致肝脏IR；另一方面，激素敏感性脂肪酶活性增强，促进周围脂肪组织分解，产生大量的游离脂肪酸，通过门静脉入肝使脂质在肝内聚积，促进肝细胞脂肪变，进一步加剧肝脏IR32。长期高脂膳食的人与动物脂肪组织中，巨噬细胞的浸润及伴随的慢性炎性反应与肥胖的病理及胰岛素抵抗密切相关。高脂饮食饲养小鼠的Chemerin、CMKLR1以及过氧化物酶体增殖体激活受体2（PPAR-y2）基因表达水平均较正常饮食饲养小鼠的增加。SELL43等通过对给予了一定浓度Chemerin的骨骼肌细胞进行体外培养、孵化的研究，得出Chemerin可以诱导骨骼肌细胞产生IR的结论。Ernst44等在动物研究中也发现，Chemerin能够恶化糖耐量异常，同时外周组织血糖摄取也下降。另外40，Chemerin作为一种脂肪因子，由于其在调节脂肪细胞合成、分化及代谢方面不容忽视的作用，Chemerin具有明显的促脂解作用。当脂肪组织和细胞脂解作用增强时，其释放的游离脂肪酸(FFA）也会相应增加，大量的FFA释放可诱导IR产生或使原有的IR情况加重。国内动物实验研究中发现45，Chemerin的水平与胰岛素水平成正相关。可见Chemerin在胰岛素抵抗中具有重要作用，肝脏是胰岛素抵抗的重要场所，研究Chemerin对肝组织胰岛素敏感性的影响尤为重要。高脂饮食结构特别是高饱和、反式脂肪酸的摄入在胰岛素抵抗发病中起重要作用，特别是内脏型肥胖与胰岛素抵抗密切相关。新的脂肪因子Chemerin在脂代谢、炎症、胰岛素抵抗中起重要作用。1.2.3库普弗细胞及其在肝脏炎性反应中的作用1.2.3.1概述库普弗细胞(Kuffer cell，KCs）是分布于肝窦壁上皮细胞间的巨噬细胞群，占肝脏细胞总数的8-12。在正常生理条件下，KCs处于静止状态，具有吞噬和清除由肠系膜血管进入门脉系统肝的细菌和细菌产物的功能，并具有特异性的免疫应答、抗肿瘤免疫、分泌细胞因子、调节微循环及物质代谢等方面的作用，从而保护肝实质细胞，维持肝内环境稳定46。KCs主要位于肝窦腔内，有时可见游离于窦周间隙(Disse），其形状不规则，披较厚的糖衣，表面不平整，布满板状或丝状伪足，并有许多皱褶、小球状突起和细长的微绒毛，其伪足常附于窦内皮细胞表面或插入窦内皮细胞间隙或经窗孔穿过Disse，与肝细胞和星形细胞接触47。KCs胞质中富含溶酶体，约占细胞体积的13.6，其内含有溶菌酶、酸性脂酶、组织蛋白酶B等多种溶酶体酶，细胞质内常见各种吞饮小泡及吞噬小体。此外，KCs表面还有内毒素(即脂多糖）受体CDl4、清道夫受体、Fc受体、补体受体、半乳糖胺受体等特异性受体及激素结合位点。KCs的结构及酶学特点均表明其具有极强的吞噬（以清除体内病原体、异物颗粒、内毒素及衰变细胞）、免疫（递呈和处理抗原，与淋巴细胞相互作用诱发特异性免疫反应）、分泌（如活性氧、血小板激活因子、花生四烯酸代谢物等损伤邻近的窦内皮细胞或使细胞上的窗孔收缩，影响肝内微循环）等功能。此外，KCs还有杀伤肿瘤细胞、抗肿瘤作用46。1.2.3.2在炎性反应中的作用KCs与多种肝病发生密切相关48。当机体受病原体感染或物理、化学损伤后，KC可被激活49。KCs的激活包括静止期、反应期、准备期和激活期等四个阶段50。静止期，KCs数量少、体积小，多半位于肝窦内；反应期，KC局部增生，全身单核巨噬细胞在肝内的聚集；准备期，KCs表型发生转化，表达CDl4等膜受体，并且功能发生改变；而激活期，细胞表达多类受体，其中CMKLR1的表达使之在Chemerin的趋化作用下向炎症处迁移，同时NF-k被激活、多种细胞因子大量分泌。活化的KCs除大量分泌转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生因子（PDGF）等细胞因子外、还产生TNF-、IL-1等多种炎性因子，参与和促进肝内的炎性反应，在机体防御、损伤及修复中起重要作用，同时还影响肝细胞、星形细胞和窦内皮细胞等的活性和功能。其中，TNF-除可直接损伤肝细胞外，反之刺激KCs自身和窦内皮细胞分泌前列腺素、白三烯、内皮素、血小板活化因子等炎性介质，进一步扩大炎性反应，加重肝损伤51。库普弗细胞表面存在诱导型NO合酶，功能异常的库普弗细胞表面诱导型NO合酶的表达增多并催化产生大量NO，后者不仅可加重肝细胞脂肪沉积，还可与氧自由基结合生成具有更强细胞毒性的过氮化物，介导肝细胞损伤以及循环衰竭94；此外，功能异常的库普弗细胞是肝脏TNF-的最主要来源，TNF-可诱导中性粒细胞和T淋巴细胞浸润，并刺激内皮细胞表面黏附分子的表达，诱导、加重炎性反应，直接和间接地引起肝细胞坏死，库普弗细胞产生的TNF-还可刺激胰岛素受体底物-l丝氨酸磷酸化，并促进其向胰岛素受体底物-l酪氨酸激酶活化抑制物转化而诱导胰岛素抵抗95。1.2.4其它相关炎症因子近年来发现有多种炎症因子在胰岛素抵抗的发生发展中扮演重要角色，如TNF-、IL6、C 反应蛋白、单核细胞趋化蛋白-1（MPC-1）等，过氧化物酶增殖体活化受体-（PPAR-）等相互作用，相互影响，参与胰岛素抵抗的发生，并贯穿与胰岛素抵抗引起的疾病的发展的始终。1.2.4.1肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF），根据来源和结构将其分为TNF-和TNF-两种。其中，TNF-是一种具有多种生物学功能的细胞因子，具有抗肿瘤作用，也是重要的致炎因子和免疫调节因子，同时与发热、恶病质形成有关52。当机体处于感染、创伤、肿瘤等应急状态时TNF-水平升高，并且与胰岛素抵抗相关53。TNF-最初发现由脂肪细胞产生，但脂肪组织中的巨噬细胞是其主要来源。近年来研究发现，许多非免疫细胞如脂肪细胞也可以分泌TNF-，在一些肥胖个体和实验动物发生发展过程中，发现脂肪细胞中的TNF-呈过度表达54。研究显示55：人体脂肪组织中TNF-表达与BMI、体脂和高胰岛素血症呈正相关，而减轻体重后TNF-水平下降；另一项人群研究显示56：TNF-水平升高伴随着胰岛素抵抗和代谢综合征发病率的增加，TNF-是胰岛素抵抗的一个独立危险因素，且主要通过参与或扩大炎性反应进而在肝脏IR中发挥作用的。TNF-致IR的可能机制有53：TNF-可以直接作用于胰岛素信号转导途径，抑制胰岛素的信号转导，减弱胰岛素的作用；TNF-还可以通过促进脂肪的分解，升高游离脂肪酸(FFA）以及刺激脂肪细胞分泌瘦素而引起IR。TNF-可直接抑制脂肪细胞的分化过程，加速脂肪分解，导致血清FFA水平升高，从而抑制肌细胞糖代谢，促进肝内糖原合成，间接诱导IR；通过刺激其他细胞或组织产生代谢效应间接作用于胰岛素信号转导系统，TNF-可刺激升血糖激素如糖皮质激素、胰高血糖素、生长激素、儿茶酚胺分泌，已经明确，提高这些激素水平可导致IR及糖尿病。TNF-可通过调节脂肪细胞的基因表达、介导脂肪组织脂解作用而间接造成IR。在肝脏炎性反应早期，TNF-的产生可以触发其他细胞因子产生并一起趋化炎症细胞聚集、杀死肝细胞以及介导包括肝纤维化在内的肝组织修复反应57。TNF-对胰岛素信号的转导途径的影响是通过对IRS的作用来完成的，即TNF-可以介导胰岛素受体底物(IRS）的丝氨酸磷酸化，从而抑制其酪氨酸磷酸化，进而影响到胰岛素PI一3K途径的信号转导，并最终减弱葡萄糖的转运，导致IR55。正常大鼠持续小剂量注射TNF-后，可发生明显的肝脏及外周组织IR58。高脂饮食大鼠肝脏TNF-表达较对照组明显增加，用TNF-抗体进行干预能够降低肝脏脂肪变性及肝纤维化，并显著改善高脂大鼠胰岛素诱导的胰岛素底物受体-1（IRS-1）和胰岛素底物受体-2（IRS-2）酪氨酸磷酸化，及蛋白激酶（Akt）和逆转录因子（FOX01）的丝氨酸磷酸化59。在脂肪细胞与原代肝细胞共培养体系中加入TNF-中和性抗体，能使肝细胞IRS-2和Akt活性部分恢复，IR状态改善60。以上实验结果表明，脂肪细胞分泌的TNF-能直接诱导肝细胞炎性反应、继而发生IR，这一过程受TNF-的调节61。在小鼠成纤维细胞（3T3-L1）前脂肪细胞中，Chemerin的表达量随着脂肪细胞的分化不断增多。TNF-在脂肪组织中表达量高，其作为一种炎症因子与血清中chemerin的水平成正相关62。TNF-可以诱导3T3-L1前脂肪细胞中Chemerin的表达，并能提高小鼠血清中Chemerin的含量63。在瘦素缺失的小鼠和瘦素受体缺失的小鼠脂肪细胞中Chemerin的含量高，检测TNF-的含量也高，因此TNF-可能与Chemerin的表达变化相关64。1.2.4.2白介素-61985年，Kshimoto等65从T细胞中首先获得IL-6cDNA克隆。IL-6是一种不稳定的糖基化蛋白，属于细胞因子家族的成员之一。IL-6由单核/巨噬细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞及血管基质细胞等产生，多种细胞分泌，在不同组织细胞中IL-6表现出不同的磷酸化而行使不同的生物学功能。肝脏的IL-6主要由KuPffer细胞、内皮细胞分泌，并以旁分泌方式作用于肝细胞，它既能刺激肝细胞合成急性期反应蛋白，又能引起再生反应，其作用主要通过IL-6受体活化细胞内一系列信号蛋白分子来实现66。近年来发现脂肪细胞和骨骼肌细胞也有分泌，IL-6以自分泌和旁分泌作用于组织细胞，有多重生物学效应。在炎性反应、免疫调节和自身免疫性疾病的发生中起重要作用。肝脏是葡萄糖代谢的重要器官，体内及体外试验均证实IL-6可介导肝脏IR。关于IL-6对肝细胞胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化的影响只有少量报道，仅限于动物实验。Senn67等研究发现，IL-6能抑制胰岛素信号转导及胰岛素作用。用IL-6处理培养的肝细胞瘤株(HePG2）及小鼠肝细胞发现，IRS-1酪氨酸磷酸化降低。并且在生理浓度胰岛素水平下，IRS-1与磷脂酞肌醇3激酶(PI3K）结合受抑，胰岛素依赖的蛋白激酶B激活受抑，糖原合成降低75。IL-6可诱导细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of eytokine signaling-3,SOCS.3）的表达增加，抑制胰岛素信号转导，加强IL-6在肝脏的作用。目前认为肝脏为血清CRP的主要来源,肝中CRP产生的主要兴奋剂为IL-6。TNF-a诱导IL-6表达的相关性，诱导NF-kB激活的相关性。此外，IL-6在肝脏还存在其他作用。Katsunori等68对大鼠进行IL-6干预，发现IL-6能够刺激肝脏TG的分泌增加而不降低甘油三酯载脂蛋白的清除率。IL-6刺激脂解并且增加FFA向肝脏转运，进一步诱导和加剧IR。1.2.4.3C反应蛋白超敏C反应蛋白(high sensitive C reactiveprotein，hs-CRP）来源于肝脏，是一种在系统发生中高度保守的蛋白，也是反映慢性亚临床炎症的重要标志，hs-CRP的免疫调节功能包括增强白细胞反应性、补体结合、清除细胞碎片等69。CRP 能够参与多种自体及外源配体相作用，其中磷酸胆碱(Phosphorylcholine, PCh）是亲和力最高的一种天然配体。磷酸胆碱存在于许多细菌中,也是真核细胞膜上鞘磷脂和卵磷脂的组成成分。然而，这些磷脂的头部在正常细胞中很难与CRP接触, 因此, 只有在受损和凋亡的细胞中, CRP 才能与这些磷脂分子结合70。CRP发挥其免疫调节活性通常与免疫细胞表面受体相关。CRP与免疫球蛋白受体（FcR）结合能够激活吞噬细胞, 包括FcR和FcR71-72。通过含免疫受体酪氨酸活化元件的激活类受体促进细胞吞噬、产生活性氧分子以及分泌细胞因子。CRP 在单核/巨噬细胞、内皮细胞及平滑肌细胞的离体效应主要可以看做是促炎和促动脉粥样硬化血栓形成.。促炎方面, CRP上调了血管细胞粘附因子1(VCAM-1）、细胞间粘附因子1(ICAM-1）、E-选择素、单核细胞趋化因子1(MCP-1）, 增强了单核细胞在人脐静脉内皮细胞(HUVEC）和冠状动脉内皮细胞(HCAEC）上的粘附73。外源性的CRP 与内皮细胞孵育后还能剂量性依赖的提高血小板的粘附74。研究显示CRP不仅仅是一种临床血清标志物，其本身还有炎症因子的作用，直接参与AS的形成和发展，并认为，CRP是急性冠脉综合征(ACS）等心血管疾病的独立危险因子，并对其诊断及预后判定具有重要的临床意义75。新近研究发现76，CRP可以通过刺激内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞产生氧自由基，从而诱发核转录因子介导的炎性反应，产生IL-6刺激肝细胞合成CRP。美国的一项健康普查77中检测了16 000余名健康成人血清hs-CRP的含量，发现hs-CRP与BM I高度相关，肥大的脂肪细胞分泌大量