生物制片的基本原理PPT课件VIP

.,1,生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法，其目的是提供在显微镜下以适度的样品，有效地对其进行形态和功能观察研究。,生物制片的目的,.,2,（一）切片法:用刀片将标本切成薄片。,石蜡切片法火棉胶切片法冰冻切片法炭蜡切片法超微切片法徒手切片法,切片法分类,（二）非切片法：用物理或化学的方法，将生物组织分离成单个细胞或，薄片或将整个组织进行整体封藏。,非切片法分类,整体制片法涂片（布）法压片（碎）法磨片法离析法,生物制片的方法,.,3,切片法制作过程（以常用石蜡切片为例）,取材固定冲洗脱水或保存透明,贴片烘干脱蜡染色封片,透蜡浸蜡包埋修块切片展片,非切片法制作过程（以整体封藏法为例）,固定冲洗（遇必要时）整体染色分化与退染,脱水透明封藏,.,4,1.动物选择,组织材料的选择非常重要，一般必须根据教学或科研的目的和要求确定。组织切片以人的材料最好但局限性大，不过一些特殊的结构动物的比人的更具有代表性。,第一节材料的采集与处理,.,5,几种动物组织取材选择简表,猴：肝、脾、肾、胰、大脑、小脑、脊髓、脊神经节、有髓神经纤维、气管、血管、淋巴结、输尿管、膀胱、子宫、卵巢、输卵管、乳腺、输精管、前列腺、食道、胃、十二指肠、结肠、甲状腺、肾上腺、脑垂体、松果体、眼球、手掌皮、内耳、鼻腔、喉、骨骼肌、腮腺、颌下腺,.,6,狗：食道、结肠、胆囊、舌、喉声带、扁桃体、淋巴结、脾、心脏、血管、肺、气管、输尿管、膀胱、输精管、甲状腺、周围神经（坐骨神经）、脊神经节、颌下腺、眼球、胃贲门、幽门、直肠肛管交界处、鼻粘膜（嗅细胞）,猫：肝、胃、十二指肠、空肠、回肠、肾、肾上腺、脑垂体、卵巢、大脑、小脑、脊髓、脊神经节、交感神经节、周围神经纤维、运动末梢（肋间肌）、骨骼肌、平滑肌、手掌皮,.,7,羊：心肌、心传导系统、子宫、宫颈、乳腺猪：肝（肝小叶）、脊髓、脑垂体、胆囊、脾兔：疏松结缔组织（皮下组织）、肠系膜、卵巢、睾丸、肺、耳廓（弹性纤维）、回肠（潘氏细胞）豚鼠：胰腺（胰岛细胞）、肾上腺、内耳、小肠（嗜银细胞）大白鼠：皮下组织（肥大细胞）、小肠（潘氏细胞）,.,8,2.组织取材的方法,总原则：取材一般先取腹腔内的器官组织，多数遵循下列顺序：肝脏、胆囊胃、肾上腺胰腺、脾小肠、结肠；然后是胸腔、盆腔器官组织；最后取神经系统。,组织取材以前，首先对该器官组织做大体检查，观察是否有病变。,.,9,1.肌组织取材肌组织取材时要注意防止因肌肉收缩肌纤维起波浪形变化而影响对肌纤维正常形态的观察。避免方法是在固定前将肌肉切成纵条，结扎并分别固定于拱形玻璃棒两端。骨骼肌应该取纵横两个切面。,2.肝脏取材肝脏左右四叶，组织学取材一般在肝脏右前叶或左外叶中部做纵切或冠状切面，然后分切成若干小块，投入固定液固。因肝是实质性器官，固定液不宜迅速渗入组织内，故肝取材不宜过大，以厚2-3mm为宜。,.,10,3.胆囊应先将胆囊与肝脏分离，用无齿镊子夹起胆囊，从一侧将胆囊剪开，倒掉胆汁，用生理盐水充分洗干净。取材时不要取贴附于肝脏的一面，可在游离面胆囊的体部做一纵切面，以被膜面附贴于滤纸上再行固定。另法：亦可直接在胆囊游离面的体部取材，取下胆囊立即附贴于滤纸再置于生理盐水中充分洗去胆汁，然后投入固定液固定，注意不要让镊子损伤胆囊粘膜。,4.胰腺一般取胰腺的尾部做横切面，因胰尾含胰岛较多，便于做胰岛细胞的特色染色研究，取材时应注意将胰腺周围的脂肪组织去掉，以免影响胰组织的固定，胰腺有各种消化酶，动物死后易于自溶，取材操作要快，保持新鲜，组织切取要小，以免发生组织自溶变性。,.,11,6.肾脏肾脏取材可采用两种方法：一，先从肾脏注射固定液，固定后取材，固定液可由肾动脉注入，同时切断肾静脉，使在固定液注入的同时，肾脏血液也同时排出。二，取出肾脏，注意保护其被膜，沿着肾的外侧缘的中部，直到深部做纵剖切面，全部切成两半，然后在肾的任一半面再做一扇形切面，皮质和髓质都应切到。,5.胃胃取材一般以空虚为好，如果胃内有储存的食物，应先用生理盐水洗干净，取材时可在胃底或胃体部做一纵切面，组织取出后洗去胃内的食物残渣，放在滤纸上铺开，防止卷缩，而后投入固定剂中固定。,.,12,7.肺肺的取材不能取边缘部位，应取肺小叶的中部，一般做横切片，以能全面看到肺内小支气管细支气管终末细支气管呼吸性细支气管肺泡囊肺泡的组织结构为好。,8.心脏主要取左心室壁，首先用解剖刀沿心脏的左缘至心尖部切开，再由心尖部沿心室中隔之平行线切开左心室的前壁和主动脉，这样左心室便全部剖开，取材一般切取左心室乳头肌部位，沿乳头肌的长轴做纵切面。,.,13,3.外科活体组织取材法,1.临床手术中多用于肿瘤组织，取材时应注意肿瘤的部位、形态、大小、颜色以及与四周组织的关系，有无完整或不完整的包膜，测量肿瘤的体积，包括长度，宽度和高度等。,2.活体小组织活体组织标本一般体积小，似米粒或芝麻，肉眼观可以看出组织病变区域和大体层次的，必须尽量按切片的面进行包埋。,.,14,4.组织取材注意事项,1.取材应遵循准确、典型、完整、适时的原则；2.研究正常结构应选取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料时，除取病理部位外，还应选取正常部位，以利于对照观察；3.取材前，要根据要求选择并配制好固定液，取材后，立即投入固定液中，以防组织自溶和腐败保持材料新鲜；4.切取材料时，刀必须锐利，动作要快且仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取也应轻拿轻放，避免材料的损坏，组织块力求小而薄0.3*0.3*0.2；5.取材要详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、断面和所用固定液等。,.,15,杀死：两层含义。一是把用于取材的动物处死；二是使用化学药品，迅速地终结生物组织的生理活性。固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活的状态固定下来，使在以后的制片过程中不发生任何变化。保存：将固定好的材料浸泡于保存液使其不发生变质。,5.杀死、固定、保存的概念,.,16,6.动物致死法,1.麻醉法2.空气栓塞法3.击头法4.断头法5.股动脉放血法,.,17,动物致死法1、麻醉法可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用4%戊巴比妥作静脉注射，剂量按动物体重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂量一般按动物体重5ml/kg。2、空气栓塞法如家兔可用50ml注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死亡。,.,18,3、击头法大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。4、断头法青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如兔子等，可用斧头迅速砍头致死。5、股动脉放血法动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。注意：上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。,.,19,在于通过固定剂，在尽量短的时间内使生物细胞或组织停止生命活动，借助化学药品的作用使其保持原来的形状和结构，同时易于后步骤的染色。固定有物理方法固定（干燥、高热、低温骤冷等）、化学方法固定（用化学试剂配制成固定液进行的固定）。,第二节固定和固定液,1.固定作用的原理,.,20,2.固定的意义和目的,1.意义只有将组织充分固定才能进行制片；固定可使要观察的组织结构尽量接近生前的正常状态（机体死亡后细胞内的酶会使蛋白质分解，细胞溶解破坏，组织变形，而且病原微生物迅速繁殖，不利于形态学观察）。,.,21,2.目的a、防止组织自溶和腐败；b、使细胞内各种成分沉淀保存下来，从而保持细胞与生活状态相近似的形态和结构；c、避免组织或细胞发生收缩或膨胀；d、能增加着色能力和媒染能力；e、对组织有硬化作用，适于切片，但又不能使材料过于坚硬或变得松脆；f、增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别；g、固定以后，又能有保存的作用。,.,22,3.固定的对象和方法,构成细胞的主要物质是蛋白质，所以固定的对象主要是蛋白质。组织固定时，应使用足够的固定液，固定液的量一般不少于组织块总体积的10倍以上（一般是20倍，多比少好）。小块组织固定法：从人体和动物取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。,.,23,局部灌注固定注射或灌注固定对某些体积过大或者固定液极难渗入的组织块或者需要对整个脏器或者动物进行固定时多使用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身。肺-可从气管、支气管或肺动脉注入固定液，然后将整个肺叶投入固定液，6-12小时后再分切。眼球-从眼后房或颈动脉注入肝、肾-经肝动脉或肾动脉注入脑-动物麻醉暴露颈动脉用注射针向着头部的方向注入,特殊固定方法,.,24,全身灌注固定多数为满足原位杂交方法取材的要求使用。对较大的动物如兔、猫、狗、猴等采用输液的方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧颈静脉切开放血。对较小的动物如鼠，可在乙醚麻醉的情况下打开胸腔，纵向切开心包膜，用注射器从左心室向主动脉方向注射（结扎紧），同时右心房开孔放血，一般在注射固定液前先用与该动物等量的生理盐水注入血管冲洗，流出的液体不见血时，再将固定液注入。,蒸汽固定法多用于比较细小而薄的组织，可用锇酸或甲醛蒸汽固定，主要用于如血液、细胞涂片或薄的组织固定。,.,25,4.组织固定的注意事项,1.组织必须新鲜，组织块不易过大，一般以厚度5mm，长宽不超过1515mm；2.防止材料因固定剂的作用而发生变形：对柔嫩而薄的材料可先摊于吸水纸上再投入固定剂；3.固定所用固定液以新配的为好，防止过久失效；4.固定剂的用量：保证组织有足够的固定剂；5.固定的时间：参考组织的种类、性质、大小、固定剂种类性质、渗透力强弱，固定的温度等；6.其他：定期摇动组织或容器可有利于固定液的渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。,.,26,5.固定液的性质和条件,1.迅速渗入组织，使解剖的组织细胞形态短期内不至于有较大变化；2.固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定；3.使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。,.,27,用于固定组织的化学试剂溶液称固定液。分单一、混合固定液两类。1、单一固定液甲醛、酒精、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、碘、锇酸等。2、混和固定液Zenken氏液、Bouin氏液、Carnoy氏液等。较好的固定液必须具备以下条件：具有强的渗透力；不会使组织过度收缩或膨胀，并能使组织内易于观察的成分凝固为不溶性物质；使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。,5.固定液,.,28,单一固定液的种类、性质及其应用酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、碘、锇酸混和固定液的种类、性质及其应用Zenken氏液、Bouin氏液、Carnoy氏液等等,固定液的类型,.,29,1、乙醇,组织保存剂，制片时的固定剂。50%以上的乙醇都有固定作用，固定浓度以80-95%为好。固定的特点：杀死快,渗透力强，可使材料变硬。用纯酒精固定时间不宜太长，否则会使材料发脆，但70%的酒精可较久的保存材料具有固定、硬化、脱水等作用无水酒精固定时穿透速度快，宜做糖原固定。但取材薄时才能固定好，也容易变脆，收缩染色不如甲醛渗透力差,.,30,即福尔马林，浓度为40%，实际只有4%甲醛，固定蛋白质最好。特点：非沉淀性固定剂，不能使白蛋白和核蛋白沉淀，但可与蛋白质化合;渗透力均匀，对组织收缩较少，能固定大块组织;对小块组织固定数小时即可，时间长没有关系；用福尔马林固定的材料，有利于核的染色，特别是对动物组织的固定效果更佳;对长期固定的标本，制备切片时须流水冲洗24小时甚至48小时。,2、甲醛,.,31,3、醋酸,醋酸又称乙酸，常在16.6以下凝成冰状固体故名冰醋酸。用1%-5%的醋酸作固定液，渗透力极强，对一般组织短时间内就可产生固定作用。醋酸可沉淀核蛋白，所以对染色质或染色体的固定和染色都很好，但它不能固定类脂物。醋酸可使细胞膨胀和防止收缩；同时由于它不能凝固细胞质中的蛋白质，组织不会硬化，因此可与引起组织收缩的液体相混合，起到相互平衡的作用。,.,32,4、苦味酸(三硝基苯酚）,苦味酸是极毒的黄色结晶，极易爆炸，常配成饱和水溶液贮存，它在水中的溶解度为0.9%-1.4%，亦可溶于酒精、氯仿等。可沉淀一切蛋白质，对类脂物无作用，也不能固定碳水化合物。渗透速度较慢。固定后细胞收缩明显，收缩率达50%以上，但不使组织硬化。苦味酸的固定时间不宜过长，否则会影响苏木精等碱性染料的染色。苦味酸固定组织的黄色，在以70%酒精脱水时加入少许碳酸锂饱和水溶液即可除去。,.,33,5、升汞（氯化汞）,是一种毒性很强的化合物，渗透力仅比醋酸弱。几乎可沉淀所有蛋白质，升汞能充分固定细胞质和细胞核，并可增加对酸性染料的亲和力，升汞能使组织收缩，但硬化作用不强，多与冰醋酸、铬酸盐及甲醛混合使用。升汞固定的材料中常存有沉淀或结晶，因此固定后用0.5%的碘酒（70%酒精洗涤，以提出升汞；然后再用70%酒精洗涤，将碘去掉；最后还要用0.2%-0.5%硫代硫酸钠溶液洗涤，彻底去掉碘黄色。,.,34,6、重铬酸钾,为橙红色结晶，性毒，为一种强氧化剂，不能与酒精、甲醛混合。同时为一种强硬化剂,渗透力差，很少单独使用。与醋酸混合后，pH在4.6时可以固定染色体，以及对细胞质和染色体产生网状沉淀作用。在未与醋酸混合pH大于5.2时，对类脂体具有良好的作用，可以固定高尔基体和线粒体，但此时对染色体不利，不能用作核的固定。常用浓度1%-3%，它固定的材料，一般不收缩，有的反而稍膨胀，但经酒精处理后可继续收缩，固定后可充分用水洗涤。,.,35,性质：灰黄色结晶，强氧化剂，剧毒优点：目前最好的固定剂之一，脂类物质唯一的固定剂缺点：渗透力弱，组织固定不均匀，价格昂贵*取材较小，固定后用过氧化氢漂洗,7、锇酸,.,36,性质：三氧化铬的水溶液。三氧化铬是红棕色结晶体，易潮解，强氧化剂，配好后必须立即使用。优点：可使蛋白质、核蛋白、核酸等产生良好的固定不溶解。缺点：渗透力弱，容易使组织收缩且过度硬化。,8、铬酸,.,37,.,38,1、FAA固定液(万能固定液),配方：50%或70%酒精90ml+福尔马林5ml+冰醋酸5ml。此液可用于一般植物组织的固定，一般薄嫩的组织用50%酒精，厚硬的组织用70%酒精，醋酸穿透力强，可缩短固定时间，有利于固定质量。一般固定5-20小时，超过时间也无妨，固定的材料不用水洗，可直接从70%酒精开始脱水。,.,39,2.卡诺固定液(Carnoys),无水乙醇3份+冰醋酸1份无水乙醇6份+氯仿3份+冰醋酸1份此液可固定细胞质和细胞核,对于花粉母细胞、胚胎以及染色体的固定均可收到良好的效果。此液由于有较多醋酸，所以固定速度很快，不同的组织固定的时间也不相同，如根尖固定15分钟；花药固定1小时；动物组织因1.5-3小时，固定无需水洗，要用纯酒精浸洗数次。,.,40,3、秦克氏液（Zenkers),细胞学中最常用的一种固定液对动物细胞质、细胞核的固定效果最佳，并有利于染色。固定时间约为18-24小时，固定后水洗12小时，以除去组织中的重铬酸钾。当酒精分级脱水至70%酒精时，可加少许碘，以提出留于组织中的汞。配方：重铬酸钾2.5g+升汞5g+硫酸钠1g+冰醋酸5ml+蒸馏水100ml先将升汞放在蒸馏水中加热溶解，然后加重铬酸钾和硫酸钠，溶后放置，同时用少量的冰醋酸调节pH至2.3。,.,41,4、波恩氏液(Bouns),配方：福尔马林25ml+冰醋酸5ml+苦味酸饱和水溶液75ml常用的改良液：1%酸铬50ml+福尔马林10ml+10%冰醋酸20ml+苦味酸饱和水溶液20ml1%酸铬50ml+福尔马林10ml+冰醋酸5ml+苦味酸饱和水溶液35ml应用范围较广，如植物组织、花粉母细胞、胚囊细胞以及动物的一些柔软组织。此液有较多醋酸，渗透力强，固定速度快。薄软组织1-3小时，较大的组织块，12-24小时，固定后直接由50%酒精逐级脱水。,.,42,5、纳瓦兴(Navaschjns)固定液,改良液:材料较柔嫩，含水量较多，可用配方I、；材料较坚硬，含水量较少，可用、V配方。分别配成甲、乙两种基液，用时临时等量配合。固定时间为12-24小时，固定后用70酒精洗涤数次。,.,43,冲洗：用洗涤剂渗透到组织间隙中去，把固定剂洗掉。冲洗的目的：以免妨碍染色或使材料在后续处理中变质。常用洗涤剂：水、低浓度的酒精。冲洗的原则:1.固定剂为酒精，或酒精混合物，一般不要求冲洗，如有必要，必须采用与固定剂中的酒精浓度相同或相近的酒精。2.凡是含有铬酸、重铬酸钾、锇酸的固定剂，必须用流水冲洗，冲洗时间应等于或多于固定时间。3.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗完毕必须在70%酒精中加碘液去汞。4.含有苦味酸的固定剂，宜选用70%的酒精进行洗涤。苦味酸的黄色在70%酒精中能自行脱去,或加入碳酸钾饱和水溶液除去。,第三节冲洗与脱水,.,44,脱水：用一种药剂把材料中的水分全部去除干净。脱水的目的：使组织中的水分完全去除，并使组织变硬。常用的脱水剂：酒精、丙酮、甘油、正丁醇、叔丁醇、酒精脱水，如需过夜，应停留在70酒精中丙酮脱水力和收缩作用都较酒精强甘油常用于藻类、菌类和柔弱材料脱水，特别在整体制片法中应用广泛正丁醇、叔丁醇均为石蜡溶剂，用其脱水后的材料不需要透明，可直接浸蜡,.,45,透明：采用苯类有机溶剂，将组织或切片中的水溶剂取代，并且达到透明的目的。目的：1、包埋前透明使组织中的酒精或者丙酮被透明剂替代，使石蜡可以顺利的进入组织中，增强组织的折光系数2、封藏前透明，增加透明度，溶解封藏剂使封片均匀紧密。透明剂：二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、丁香油。,第四节透明与透明剂,.,46,常用透明剂的种类和使用方法,1.二甲苯为最常用透明剂。无色透明液体，长期接触可刺激呼吸道粘膜。透明组织块时所用镊子必须干燥，不得将水滴混入二甲苯，为减少组织变形和收缩，可先经纯酒精与二甲苯或苯的混合液（1:1）。如脱水不净，用二甲苯透明后，将出现下列不良后果：1、如材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡液不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果；2、切片内留微量水分，封藏后会发生乳白色云雾状，在显微镜下观察时可见许多密集水珠把组织掩盖，切片作废。,.,47,3.甲苯性质同二甲苯，但透明较慢,4.氯仿（三氯甲烷）透明能力比二甲苯和苯差，透明时间至少24小时，多用于大块组织透明。,5.香柏油作为透明剂效果较好，但透明时间长，至少24小时，与石蜡不易融合，不适用于透明组织。,2.苯用途与二甲苯相似，对组织收缩小，但因吸入毒性大，较少使用。,.,48,6.苯甲酸甲酯难溶于水，溶于乙醚，组织块脱水至95%酒精后可直接转入苯甲酸甲酯透明，透明时间12-24小时，对组织块收缩和硬化很弱，可用于火棉胶切片。,7.苯胺油又名安尼林油，微溶于水，能与醚、醇、苯等混合，暴露于日光很快变为棕色，应避光保存。,.,49,包埋：将融化的包埋剂连同浸透包埋剂的材料一同倾倒于特制的容器内的过程。组织包埋前，常利用石蜡将透明剂去除，使石蜡完全浸入细胞的每个部分，使石蜡与材料成为一个整体而便于切片，称为组织浸蜡。,第五节包埋与包埋剂,.,50,浸蜡的目的和方法,组织组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡，目的是用石蜡代替组织中的透明剂，并渗入组织内部使软组织变为适当硬度，以利于切片和观察。,.,51,石蜡分为软蜡和硬蜡。由于石蜡冷凝后脆性较大，可加入一定的黄蜂蜡增加韧性（蜂蜡与石蜡的比例为1:5）。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56，在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。,新蜡应多次熔化，使其中所含的挥发性物质蒸发，以免包埋时出现蜡花。浸蜡时必须经过数次纯石蜡，使其中剩余的透明剂完全去尽。在组织更换蜡杯时要间隔一定时间，尽量减少组织中含有的二甲苯被带入最后的纯蜡杯中，而影响浸蜡的程度。,.,52,浸蜡剂的种类,1.石蜡：最适合的包埋石蜡熔点为54-682.火棉胶：为三硝基纤维素，由浓硝酸和浓硫酸作用于脱脂棉而得，适用于大块组织和眼球等。3.碳蜡：多乙烯醇，为水溶性油蜡。,.,53,组织包埋,石蜡包埋法,快速石蜡包埋法,火棉胶包埋法,.,54,石蜡包埋法,石蜡是动植物和人体组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋蜡须在温箱内经多次熔化，用新蜡和旧蜡混合熔化后沉淀的干净蜡。,1.浸蜡时间一般厚5mm的实质性器官（肝、脾、肾）总浸蜡时间为2-3小时。小胚胎可缩短为30min。,组织浸蜡时，可在温箱中放置3-4个蜡杯，按软蜡1、软蜡2、硬蜡的顺序浸蜡，间隔一定时间更换一个蜡杯，可使石蜡充分渗入组织。,.,55,组织体积大小、浸蜡时间参考表,.,56,石蜡包埋过程,1.装好金属包埋框，或折好纸盒2.点燃酒精灯，准备好镊子，需要标记的写好标签3.将已熔化的包埋石蜡，倾入包埋框或纸盒中，倒满即可4.组织置入包埋框时，首先应明确组织的方位，将组织块平置入框底。将标签放置蜡块上5.包埋框内的蜡逐渐凝固后，若表面已凝结为固体状，即可放在冷台上冷却，加速其凝固，但不能过早放入6.蜡块完全凝固后即可取出。,.,57,石蜡包埋注意事项,1.镊子要随用随烤热，以免石蜡凝结在镊子上，造成蜡块凝固不均匀；2.包埋过程要迅速，组织取出的时间要尽量缩短3.包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如出现白色浑浊，应考虑：脱水不彻底；包埋蜡温度低，过早凝固；石蜡不纯4.包埋箱的温度必须保持恒定5.包埋不理想应重新将蜡块熔化，重新浸蜡和包埋6.尤其在用纸盒包埋时，蜡块表面冷却后必须放入冷水或冷却台使其迅速凝结为蜡块。,.,58,快速石蜡包埋法,适用于快速诊断，且组织块太小或太碎，无法使用冰冻切片方法制片时,1.将组织块投入40%甲醛10ml，95%乙醇85ml，冰醋酸5ml的混合液，固定兼脱水2min2.纯丙酮3min3.纯丙酮3min4.苯2min5.浸蜡5min,快速包埋组织后进行冷却切片，烤片、脱蜡、染色及封固。,.,59,火棉胶包埋法,适用于大块组织和眼球等，可避免纤维组织和肌肉组织过度硬化，减少纤维组织的收缩和扭转，有利于保持组织的原有结构。其缺点是操作过程过长，不适于病理和尸检制片，对神经组织和眼球较好。,.,60,1.将组织块固定、水洗后投入70%乙醇中6-24小时2.浸入80%乙醇中6-24小时3.浸入90%乙醇中6-24小时4.浸入95%乙醇中12-24小时5.浸入100%乙醇中12-24小时6.浸入乙醚和纯乙醇等量混合液中24小时7.浸入2%火棉胶（2g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24-48小时。,火棉胶包埋法参考步骤,.,61,8.浸入4%（4g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24小时至数周9.浸入8%（8g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24小时至数周10.浸入16%（16g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中1周11.包埋时，以16%火棉胶液倒入平底玻璃皿内，将组织平放埋入其中，上面盖好。溶液慢慢蒸发，直到用手指轻压火棉胶不再出现指纹时，即达到合适的硬度。已经包埋好的火棉胶组织块可存放于70%乙醇中备用。,.,62,一、蜡块的修整与固着二、切片过程（一）切片机：旋转切片机（二）切片刀通常分为平凹型、双平型、双凹型。切片刀的角度，一般以58度为宜。三、石蜡切片时常见问题、原因及补救,第六节切片与粘片,.,63,1.载玻片的处理清洁液浸泡5-12小时清洁液配制方法：重铬酸钾300g溶于3000ml蒸馏水，缓缓加入浓硫酸300ml,1.切片前的准备工作,2.流水冲洗12-24小时，蒸馏水冲洗3-5遍,3.95%酒精浸泡2小时，擦洗，晾干备用,.,64,2.粘片剂的选择,1.蛋白甘油取鸡蛋一个，取出蛋白混入等量纯甘油，混合溶解后过滤，于冰箱中保存，为长期存放可加入麝香草酚2.铬钒明胶液500-800ml蒸馏水加温溶解5g明胶，完全溶解后加入铬钒0.5g，定容至1000ml。若有残渣要过滤3.氨丙基三乙氧硅烷（APES）干净载玻片APES（按1:50比例用丙酮稀释）10s丙酮冲洗10s蒸馏水冲洗20s晾干备用,.,65,3.修块,将包埋的组织周围过多的石蜡切去，四周留约1.5-2mm的边，上下边要平行,4.磨刀,一般使用自动磨刀机进行，可在显微镜下检查切片刀，主要观察刀口是否平整、有无缺口,5.捞片、展片机的准备,.,66,1.将预先冷却的组织蜡块装在切片机固定器上，再装切片刀2.调整切片刀与组织块平面的倾角关系，一般为10-15度角3.左手持毛笔，右手转动切片机把，切片带出来后，用毛笔轻轻托起，再用镊子轻摄蜡片，以正面放入展片箱中，待摊平后捞片4.左手持清洁好的载玻片一端投入水中附贴切片，右手用镊子辅助推动切片移至载玻片上5.在空气中稍晾干即可烤片。烤片时间一般在45几小时至过夜。,6.切片：石蜡切片法制作过程,.,67,任何石蜡切片、冰冻切片等，如果不经过染色，在显微镜下只能看到细胞及其他组织的轮廓，即使由于组织内部各种物质的折光系数不同，从光线的明暗上能观察到一些结构，但远不能满足观察和诊断等目的。染色的目的就是将染料配制成溶液，将组织烤片浸入染色剂内，经过一定的时间，使组