生物课件-第四章 微生物的培养.ppt

,第四章微生物的营养和培养第四节微生物的培养,本节内容,1微生物的生长2测定微生物生长繁殖的方法3微生物的群体生长规律4微生物的培养方法5环境因素对微生物生长的影响,1、微生物的生长,1.1微生物生长繁殖的概念微生物的生长是指微生物通过新陈代谢把营养物质转变成细胞物质，增加个体重量的过程。微生物的繁殖是指细胞生长到一定程度进行分裂，产生同亲代相似的子代细胞的过程，导致微生物数量的增加。,个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长个体繁殖,微生物的生长繁殖是在内外各种因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可以作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、变质微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关，所以对微生物的生长繁殖及其控制规律的认识十分必要。,2测定微生物生长繁殖的方法,2.1细胞物质总量测定法直接法：（1）体积测定法是一种较为粗放的方法，通常用于初步比较。将待测培养液放在刻度离心管中做自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。,1.2微生物生长量的测定,（2）称干重将菌种接种到液体培养基内做振荡培养，经一定时间后过滤收集菌丝，洗净后将菌丝置于80100烘箱中烘至恒重，或在低温（40）下减压干燥后测菌丝重。固体培养基上，当培养的菌丝生长到一定阶段后，可经过短时高温杀菌，使琼脂溶化，滤出菌丝，用热蒸馏水洗净，再烘干测干重。,（1）含氮量测定法蛋白质是细胞的主要成分，含量一般比较稳定，所以可以用蛋白质的量来确定细胞物质的总量。氮是蛋白质的重要组分，氮含量与蛋白质关系如下：蛋白质总量含氮量6.25。因此，先用凯氏定氮法测出细胞的含氮量，然后根据对相应关系计算出细胞物质总量。,间接法：,（2）DNA含量测定法,DNA与DABA2HCl（20的3,5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液）能显示特殊的荧光，根据此原理可以测出DNA含量，即可推算出细菌的总数。每个细菌平均含有DNA8.41014g。,（3）比浊法微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物浑浊度的增加。用不同浓度的BaCl2与稀硫酸配制成10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，表示10个相对的细菌浓度，某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液大致浓度。,间接法：,2.2微生物细胞数的测定方法,（1）直接计数法直接计数法适用于单细胞的细菌、酵母、原生动物等微生物的细胞计数，测出的结果表示总菌数。显微计数法,显微计数法是广泛使用的方法，有各式各样用来计算菌数的计数器。这些计数器的底面都有棋盘式刻度，可以对一定面积内微生物进行计数。,直接显微计数,血球计数板法测总菌数,这是用来测定一定容积中细胞总数目的常规方法。血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。在进行细胞计数之前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有0.1mm高度的间隙，含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中，然后数出每小格菌数再经过换算可以得到总细胞数。,血球计数板法测总菌数,血球计数板方格示意图,这种方法特点是测定简便、直接、快速，但只适用于个体较大的微生物，如酵母、霉菌的孢子等；此外，测定的是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体，若想要测定活菌的个数，还得借助其他方法配合。,比例计数法是一种粗放的计数方法，将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按照一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。,Coulter电子计数器稀释的培养物放在装有电解质的贮液槽中，利用真空通过小孔吸入预定体积的电解质溶液（包括培养物）。由于电极间有电压，当细胞通过小孔的时候，电阻增加，引起电流脉冲，记录得到的脉冲数即为菌数。Coulter电子计数器有各种直径的孔，对直径13m的细菌，必须用最小孔径（30m），对较大的细胞（如酵母、原生动物等）可用较大孔径的计数器。,1、有孔管2、细胞悬浊液3、汞柱压力计4、控制电极,（2）间接法平板菌落计数法,平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。做法是：取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固之前均匀混合，或用菌液涂布于已凝固的固体培养基上。经保温培养后，用平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释倍数，即可算出原菌液的含菌数。,平板菌落计数法,在一个9cm的培养皿平板上，一般以出现30300个菌落为宜。要注意的是，平板菌落计数法对产甲烷菌等严格厌氧菌的计数不适用。,平板计数与系列稀释,10-3,10-5,10-4,10-6,比浊法测浊度,这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是微生物培养物在生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度(或透光度)或浊度可以反映细胞的浓度。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。,3微生物的群体生长规律,微生物群体生长规律，依据培养方式、微生物种类等的不同而变化，在分批培养、连续培养及同步分裂培养时其生长规律有明显差别。,3.1分批培养,分批培养：将微生物置于一定的培养基中，经培养后一次收获，这种培养方式称为分批培养。在这种培养方式下，微生物所处的环境在不断变化，营养物不断消耗、代谢产物不断积累，使微生物不能长久地停留在对数生长期。,（1）细菌的典型生长曲线,微生物在化学成分一定的恒容积液体培养基中进行分批培养，其生长速度随时间发生着有规律的变化。细菌的典型生长曲线可以很好的反映该规律。根据细菌生长速率常数的不同，可把曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期。,延滞期又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期的微生物有如下特点：a.生长的速度常数为零；b.细胞的体积增大，DNA含量增多，为分裂做准备；c.合成代谢旺盛，核糖体、酶类的合成加快，易产生诱导酶；d.对不良环境（如pH值、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质）敏感。,为了提高生产效率，发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期。主要方法有：以对数期的菌体做种子菌，因为对数期的菌体生长代谢旺盛，繁殖力强，抗不良环境和噬菌体的能力强，所以能使延滞期缩短；适当增大接种量，接种量大，延滞期短，接种量小，延滞期长；培养基的成分，为了减少培养基营养成分的差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即种子培养基尽量接近发酵培养基。,对数期又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的世代时间短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。对数期微生物的生理特征是：a.细胞高速生长；b.温度影响细胞生长繁殖速度，接近最适生长温度则繁殖速度快；c.用处于对数后期的细菌接种合适的发酵培养基可以缩短延滞期。,对数期内细菌细胞数目是以稳定的速率按几何级数增加的，若对数期t1时的菌数为x1，经过n次繁殖后t2时的菌数为x2，则x2=x12n。在对数期，以下三个参数尤为重要：a.繁殖代数（n），从图可以得出：x2=x12n以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2n3.322（lgx2lgx1）,b.生长常数（R），由生长速率常数的定义可知：R,c.代时（G），由平均代时的定义可知：G,对数期,影响微生物对数期世代时间的因素较多，最重要的因素有菌种、营养成分、培养温度。,表41不同细菌的代时,稳定期稳定期又称最高生长期或恒定期。由于营养物质的逐渐消耗和有生理毒性的代谢物质在培养基中的积累，以及其他条件（如pH值、氧化还原电位等）对细菌生长不利的改变，到对数期末期，细菌分裂速度降低，繁殖率和死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定，从而进入稳定期。,稳定期微生物主要生理特征如下：a.细胞分裂速率降低，细胞质内积累细胞储存物，如糖原、脂肪粒、多聚羟基丁酸和多聚偏磷酸盐等；大多数产芽孢细菌则在此时产生芽孢。b.代谢活动继续进行，并保持相当水平。c.稳定期可以持续相当长的时期，时间长短因菌种和培养条件而异。由于稳定期是积累代谢产物的重要阶段，生产上常常通过补加养料、调节pH值、调整温度等措施来延长稳定期，以积累更多的发酵产物。,衰亡期稳定期以后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负增长”（R值为负），此阶段称为衰亡期。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长的微生物越来越不利，从而引起微生物细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。衰亡期微生物的生理特征为：a.细胞内颗粒更明显，出现液泡，细胞出现多种形态，包括畸形和衰退形；b.因细菌本身所产生的酶和代谢产物的作用使菌体分解死亡；c.衰亡期和其他各期相比相对较长，其时限决定于细菌本身的特性及环境条件。,以上是细菌正常生长所经过的各个生长期。酵母等单细胞微生物的生长情况基本类似。工业发酵过程中，特别是生产初级代谢的发酵过程一般只经历前面3个阶段，若生产菌体产品也可能只经过前面两个生长阶段。,（2）丝状真菌的生长曲线,在液体培养基或深层培养基中，以菌丝干重作为衡量的指标，可得到如图所示的生长曲线。丝状真菌的生长过程大致可分为下列3个阶段：生长停滞期、迅速生长期、衰退期。,（2）丝状真菌的生长曲线,无冠构巢曲霉的生长曲线,迅速生长期迅速生长期内菌丝干重迅速增加，其干重的立方根与时间呈直线关系。衰退期真菌进入衰退期的标志是菌丝体干重下降，一般在短期内损失很快，以后则不再变化。,生长停滞期造成生长停滞期的原因有两种：一是孢子萌发区的真正的停滞期；另一种是生长已开始但无法测量。,J.Nicklin等人认为，真菌在给定的培养基上生长，经过停滞期、对数期、线性期、减速期、稳定期和衰退期。,真菌的生长曲线,3.2连续培养,连续培养：又叫开放培养，是相对分批培养或密闭培养而言的。连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，对稳定期到来的原因有较充分的认识后，在对数期的培养容器内不断添加新鲜培养基，同时不断放出培养物，从而使微生物所需营养能够及时得到补充，有害的代谢产物及时排除，菌体生长不受影响，始终维持在对数生长期。连续培养不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可以提高发酵工业的生产效益和自动化水平，此法已成为目前发酵工业的发展方向。,控制单级连续培养的方法有两种：恒浊培养和恒化培养。,（1）恒浊培养不断调节流速而使培养物的浊度保持恒定的连续培养称为恒浊连续培养，又称恒浓度连续培养。其原理是根据培养器中微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检验培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。,恒浊培养系统,在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。对于以获得大量菌体为目的的工业化生产来说，利用恒浊法培养可获得较好的经济效益。,（2）恒化培养与恒浊法不同的是，恒化法是使培养液流速保持不变，即控制恒定的流速，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养方法。,恒化培养系统,在恒化培养中必须将某种营养物质限制在较低的浓度，以作为生长限制因子，而其他的营养物均需过量，使微生物的生长速率主要取决于限制因子的浓度。随着细菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者作用的结果出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速平衡。,恒化培养既可以获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，但能保持稳定菌体密度的菌体。恒化法连续培养主要用于实验室的科学研究中，特别是用于与生长速率相关的各种理论研究中。,连续发酵与分批发酵的比较,连续发酵的优点：自控性便于用各种仪表进行自动控制；高效它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化，缩短了生产时间并提高了设备的利用效率；产品质量较稳定；节约了大量的动力、人力、水和蒸汽，使水、气、电的负荷减少；,连续发酵与分批发酵的比较,连续发酵的不足：菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，即使是自发突变率很低，也难以避免变异的发生；容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏、通气系统不出任何故障，是极其困难的，因此，“连续”是有时间限制的，一般可达数月至12年；连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。,3.3同步培养,同步培养又称同步生长，主要用于微生物生理方面的研究，以及遗传育种。在分批培养中，细菌群体以一定的速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，即使细胞处于同一生长阶段，但它们的生理状态和代谢活动也不完全一致，有的分裂早、有的分裂晚，细胞的“年龄”是不一致的，这就给研究细胞个体生长带来了困难，为了解决这一问题，必须设法使微生物群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂，因而人们发明了单细胞的同步培养技术。,获得同步培养的方法,获得细菌同步培养的方法主要有2类：其一是调整生理条件诱导同步性，主要是通过控制环境条件，如温度、光线及处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步；其二是机械法（又称选择法），它是利用物理方法从不同步的细菌群体中选择出同步的群体，一般可用过滤分离法或梯度离心法来达到。比较两种方法，由于诱导法可能导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中尤为明显。,在选择法中，有代表性的是硝酸纤维素薄膜法。人们根据某些细菌会粘附在硝酸纤维微孔滤膜上的原理，设计了一个具体的选择方法：将非同步的细菌液体培养物通过微孔滤膜，使细胞吸附其上；然后将滤膜反置，再以新鲜培养液滤过。此时，一些没有粘牢固的细胞先被冲洗掉，接着洗脱的是那些新分裂形成的细胞，于是就获得了同步生长。,用硝酸纤维素薄膜法获得同步生长的细菌,值得注意的是：同步生长的细菌，在培养过程中会很快丧失其同步性。例如，在第一个细胞分裂周期中，开始细胞数一直不增加，到后来，数目突然增加一倍；在第二个分裂周期时，情况就没有那么明显了；到第三个周期时，几乎完全丧失同步性。原因是不同个体间细胞分裂周期一般都有较大的差别。,作业,1、某种细菌在一定的条件下测得对数期生长曲线如下图所示，计算该细菌的繁殖代数n、生长速率常数R、代时G。,2、单细胞微生物的典型生长曲线可分为几期？各期有何特点？3、什么叫做连续培养？比较恒浊培养和恒化培养的方法及特点。,微生物的一切生命活动都离不开环境。同一种微生物在不同的环境中会有不同的表现，因此，研究微生物不能脱离环境条件。微生物的生长繁殖受到各种生物和非生物的环境条件的影响。本节只讨论非生物的环境条件，即物理和化学条件对微生物生长繁殖的影响，并讨论环境因素与微生物生长繁殖的关系在食品工业中的应用。,5影响微生物生长的因素,本节内容,5.1温度5.5pH值5.2干燥5.6O25.3渗透压5.7超声波5.4辐射5.8化学消毒剂,环境条件对微生物生长繁殖的影响,环境条件对微生物生长繁殖的影响大致可分为三类：第一类：适宜的环境，微生物能正常地进行生命活动；第二类：不适宜的环境，微生物正常的生命活动受到抑制或被迫暂时改变原有的一些特性；第三类：恶劣的环境，微生物死亡或发生遗传变异。,几个有关的术语,防腐：是一种抑菌措施。利用一些理化因素使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又没有死亡的状态。,蜜饯,糕点,饮料,调味品,酱菜,几个有关的术语,消毒：是指杀死所有病原微生物的措施，可达到防止传染病的目的。消毒作用的物质称为消毒剂。,煮沸消毒,环境消毒,巴氏奶,几个有关的术语,灭菌：是指用物理或化学因子，使存在于物体中的所有生活微生物，永久性的丧失其生活力，包括耐热的细菌芽孢。这是一种很彻底的杀菌方法。,高压灭菌,火焰灭菌,几个有关的术语,商业灭菌：这是从商品角度对某些食品所提出的灭菌方法。是指食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或是仅能检出极少数的非病原微生物，并且它们在食品保藏过程中，是不可能进行生长繁殖的，这种灭菌方法就叫做商业灭菌。商业无菌：食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌.,无菌：即没有活的微生物存在存在的意思。如菌种制备的无菌操作、食品加工过程中无菌罐装技术；死亡：是指微生物不可逆的丧失其生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。,几个有关的术语,5.1温度,温度是影响微生物生长繁殖的最重要的因素之一。在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，温度上升到一定程度，则开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降直至死亡。,与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这3个重要指标，这就是生长温度的3个基本点。,最低生长温度（一般为105，极端为30）最适生长温度最高生长温度（一般为8095，极端为105300）,生长温度三基点构成,生长温度三基点,嗜冷菌20（一般为15）,中温菌20-45,嗜热菌45（一般为50-60）,最低生长温度：是指微生物能进行生长繁殖的最低温度界限。处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长完全停止。不同的微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而变化。,最适生长温度：是指某菌分裂代时最短或者生长速率最高时的培养温度。同一微生物在不同的生理生化过程中有着不同的最适温度。,最适温度,生长量最高时的培养温度,发酵速度最高时的培养温度,累积代谢产物最高时的培养温度,因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。例如，嗜热链球菌的最适生长温度为37，最适发酵温度为47，累积产物的最适温度为37。,最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞极易衰老和死亡。,致死温度：最高生长温度再进一步升高，便可杀死微生物。这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。致死温度与处理时间有关。在一定的温度下处理时间越长，死亡率越高。严格地说，一般以10min为标准时间，测定微生物的致死温度一般在生理盐水中进行，以减少有机物质的干扰。,微生物按照其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。,表不同温型微生物的生长温度范围,5.1.1低温型微生物又称嗜冷微生物，可在较低温度下生长。它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中。嗜冷微生物常使冷藏食品腐败变质，有些肉类上的霉菌如芽枝霉在10仍能生长，荧光极毛菌可在4生长，并造成冷冻食品变质。低温也能抑制微生物的生长。在0以下，菌体内的水分冻结，生化反应无法进行，微生物停止生长。有些微生物在冰点下就会死亡，主要原因是细胞内水分变成了冰晶，造成细胞脱水或细胞膜的物理损伤。因此，生产上常用低温保藏食品，各种食品的保藏温度不同，可分为寒冷温度、冷藏温度和冻藏温度。,寒冷温度（1415）在室温和冷藏温度之间，嗜冷微生物能在这一温度范围内生长，但生长比较缓慢，保藏食品的有效期较短，一般适用于储藏果蔬食品。冷藏温度在07之间，在这一温度范围内，微生物活动已显著减弱，一些嗜冷性的微生物尚能缓慢生长，温度在6以下能阻止所有能引起食物中毒的病原微生物生长（除肉毒杆菌E型）。冷藏温度可以用于储存果蔬、鱼肉、禽蛋、乳类等食品，不同食品的保藏有效期不同，差异较大，对多数食品来说，保藏有效期短。冻藏温度低于0以下的温度。在18以下的温度几乎足以阻止所有微生物的生长。在冻藏温度下可以较长期的保藏食品。,5.1.2中温型微生物绝大多数微生物属于这一类，最适生长温度在2040之间，最低生长温度1020，最高生长温度4045。又可以分为嗜室温和嗜体温型微生物。嗜体温型微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限温度范围为1045，最适生长温度与其宿主体温相近，在3540之间，人体寄生菌为37左右。引起人和动物疾病的微生物、发酵工业应用的微生物菌种以及导致食品原料和成品腐败变质的微生物，都属于这一类群的微生物。因此，它与食品工业的关系十分密切。,5.1.3高温型微生物它们适于在4550以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机质中。能在5570中生长的微生物主要有芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、高温放线菌属；此外，还有链球菌属和乳杆菌属。有的可在近100的高温中生长。这类高温型的微生物，给罐头工业、发酵工业等带来了一定困难。,5.1.3高温型微生物高温型微生物的耐热机理可能是：菌体内蛋白质和酶更能抗热，尤其是蛋白质对热更稳定；蛋白质合成机构核糖体和其他成分对高温抗性也较强；细胞中的饱和脂肪酸含量较高，比不饱和脂肪容易形成更强的疏水键，可保持在高温下的稳定性，并具正常功能。,5.1.4热对微生物的致死作用如果超过了最高生长温度可导致微生物的死亡。高温致死的机理是微生物蛋白质和核酸发生不可逆的变性，或者是其他成分遭到破坏。高温致死微生物的作用，广泛用于医药卫生、食品工业及日常生活中。在食品工业中微生物耐热性常用以下几个数值表示：热力致死时间、D值、Z值、F值。,（1）热力致死时间（thermaldeathtime，TDT）是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间，称热力致死时间，或称热死时间。,热力致死时间曲线,（2）D值（decimalreductiontime）在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90的活菌被杀死）时，所需要的时间（min），即为D值。,热力致死速率曲线,（2）D值（decimalreductiontime）测定D值时的加热温度，可在D的右下角表明。例如：含菌数为105/mL的菌悬液在100的水浴中，活菌数降低至104/mL时，所需要的时间为10min，该菌的D值即为10min，即D10010min；如果加热温度为121.1，其D常用Dr表示。,（3）Z值如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90的加热时间）所需要升高的温度（），即为Z值。,（4）F值在一定的基质中，其温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（min），即为F值。,5.1.5影响微生物对热抵抗力的因素（1）菌种一般规律：嗜热菌的抗热力大于嗜温菌和嗜冷菌；芽孢菌大于非芽孢菌；球菌大于非芽孢杆菌；革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌；霉菌大于酵母菌；霉菌和酵母的孢子大于其菌丝体。细菌和霉菌的菌核抗热力特别强。（2）菌龄同样的条件下，对数生长期的菌体抗热力较弱，而稳定期的老龄细胞较强，老龄的细胞芽孢较幼龄芽孢抗热力强。,（3）菌体数量数量越多，抗热力越强，这是因为加热杀死最后一个微生物所需要的时间也越长；而且微生物聚集在一起时，其受热死亡不是同时进行的而是有先有后，同时菌体能分泌一些有保护作用的蛋白质物质，菌多则分泌的保护物质也越多，抗热性也越强。,（4）基质因素微生物的抗热力随含水量的减少而增加；基质中的脂肪、糖、蛋白质等物质对微生物有保护作用，微生物的抗热力随这类物质的增多而增强；pH值范围在7左右时，微生物的抗热力最强，pH值上升或下将都可以降低微生物的抗热力，特别是在酸性环境中微生物的抗热力减弱更明显。,（5）加热的温度和时间加热的温度越高，微生物的抗热力越弱，越容易死亡；加热的时间越长，热致死作用越大。在一定的高温范围内，温度越高杀死微生物所需的时间越短。另外，其他因素如某些盐类等，在基质中有降低水分活性的作用，从而增强抗热力，个别盐类如钙盐、镁盐可减弱微生物对热的抵抗力。,5.1.6热灭菌法食品工业中常用的灭菌方法很多，大体可以分为干热灭菌法和湿热灭菌法，湿热灭菌法主要是通过蒸汽杀死微生物，由于热蒸汽的穿透力较热空气强，所以，无论是对芽孢杆菌还是非芽孢杆菌在同一温度下效果都比干热法好。干热灭菌法包括火焰灭菌法和干燥箱灭菌法。湿热灭菌法包括煮沸消毒法、巴氏灭菌、超高温瞬时灭菌法、高压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法。,（1）干热灭菌法火焰灭菌法：其特点是灭菌快速、彻底。常用于接种工具，其使用范围有限。干热灭菌法：主要是在干燥箱中利用热空气进行灭菌。通常160处理12h可达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。,（2）湿热灭菌煮沸消毒法：物品在水中100煮沸15min以上，可杀死细菌的、营养细胞和部分芽孢，这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。巴氏灭菌：灭菌温度一般在6085，处理1530min，可以杀死微生物的营养细胞，但不能达到完全灭菌的目的。常用于不适于高温灭菌的食品，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌而不影响它们的风味和营养。,（2）湿热灭菌超高温瞬时灭菌法（UHT）：灭菌温度在135137，处理35秒，即可杀死微生物的营养细胞和耐热性的芽孢细菌。这种杀菌方法已经广泛用于各种果汁、牛乳、花生乳、酱油等液态食品的杀菌。,高压蒸汽灭菌法是实验室和罐头食品工业中的常用的灭菌方法，在高压灭菌锅中进行，锅内蒸汽压升高时，温度升高。一般采用9.8104Pa的压力，121.1处理1530min，也可以采用较低温度（115）持续处理30min左右的方法。,卧式杀菌锅,立式杀菌锅,间歇灭菌法是用流通蒸汽反复灭菌的方法，常常温度不超过100，每日一次，加热时间为30min，连续3次灭菌，杀死微生物的营养细胞。每次灭菌后，将灭菌的物品在2837下在培养，促使芽孢发育成为繁殖体，以便在连续灭菌中将其杀死。,5.2干燥水分对维持微生物的正常生命活动是必不可少的，而干燥会造成微生物失水代谢停止以至死亡。不同的微生物对干燥的抵抗力是不一样的。影响微生物对干燥抵抗力的因素很多，干燥时温度升高，微生物易死亡；在低温下干燥时，微生物的抵抗力强；干燥的速度快，微生物的抵抗力强，缓慢干燥时，微生物死亡多。食品工业中常用干燥法保藏食品。,5.3渗透压大多数微生物适于在等渗的环境中生长，若至于高渗溶液，细胞会脱水收缩引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡；在低渗溶液中或水中，细胞会吸水膨胀，甚至导致细胞胀破死亡。一般微生物不能耐受高渗透压，因此食品工业中常利用高浓度的盐或糖来保存食品，但也有一些微生物耐高渗透压的能力较强。,5.4辐射电磁辐射包括可见光、外红线、紫外线、X射线和射线等，这些均具有杀菌作用。可见光、红外辐射和紫外辐射的最强来源是太阳，但由于大气层的吸收，紫外辐射和红外辐射不能全部到达地面；而波长更短的X射线、射线、射线，往往引起水和其他物质的电离，对微生物起有害作用，故常作为一种灭菌措失。紫外线波长以265266nm的杀菌力最强，其杀菌机理非常复杂。杀菌效果因菌种及生理状态而异，照射时间、距离、剂量的大小也有影响，由于紫外线的穿透能力差，不易透过不透明的物质，因此在食品工业中广泛应用紫外线照射来为室内空气及物体表面消毒，也有用于饮用水消毒的。,5.5pH值微生物生长的pH值范围很广，一般在28之间，有少数种类还可以超过这个范围，而绝大多数种类生长在59之间。不同的微生物都有其最适pH和一定的pH值范围，即最高、最适与最低3个数值。同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理过程中，也要求不同的最适pH值，这对发酵工业中pH值的控制和积累代谢产物特别重要。,3.5pH值微生物在其代谢过程中，细胞内的pH值相当稳定，一般都接近中性，保护了核酸不被破坏和酶的活性；但环境的酸碱度会被改变，使培养基的原始pH值发生变化。原因是：糖类和脂肪代谢产酸；蛋白质代谢产碱；其他物质代谢产酸或碱。在发酵工业中，及时调整发酵液的pH值，以利于积累代谢产物是生产中一项重要的措失。,5.6O2氧气对微生物的生命活动有着重要的影响，按照微生物生长与氧气的关系，可把微生物分成好氧菌和厌氧菌，而好氧菌又可以分为专性好氧菌、兼性厌氧菌和微好氧菌；厌氧菌分为专性厌氧菌和耐氧菌2种。,5.6.1专性好氧菌要求必须在有氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终受氢体，细胞有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌，如米曲霉、醋酸杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌等。,5.6.2厌氧菌厌氧菌的特征是：分子氧对它们有毒，即使是短期接触空气，也会抑制其生长甚至死亡；在空气或者含10CO2的空气中，它们在固体或者半固体的培养基上不能生长，只能在深层无氧或低氧化还原电位的环境下才能生长；其生命活动所需要的能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。常见的厌氧菌有肉毒梭状芽孢杆菌、嗜热梭状芽孢杆菌、双歧杆菌属以及各种光合细菌和产甲烷菌等。厌氧菌的种类相对较少，但近年来发现了越来越多的厌氧菌。,5.6.3兼性厌氧菌兼性厌氧菌在有氧或无氧的条件下都能生长，但在有氧的条件下生长得更好；有氧时进行呼吸产能，无氧时进行发酵或无氧呼吸产能；细胞内含有SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌，如酿酒酵母、大肠杆菌和普通变形杆菌等。,5.6.4微好氧菌只能在较低的氧分压下才能正常生长的微生物，也是通过呼吸链以氧为最终氢受体而产能。例如，霍乱弧菌、一些氢单胞菌、拟杆菌属和发酵单胞菌属。,5.6.5耐氧菌一类可在分子氧存在时进行厌氧呼吸的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，但分子氧存在对它没有毒害作用。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量；细胞内存在SOD和过氧化物酶，但没有过氧化氢酶。一般乳酸菌多数是耐氧菌，如乳链球菌、乳酸乳杆菌等。,5.7超声波超声波具有强烈的生物学作用，它使微生物致死的机理是