第一章实验室与基本操作2014年

第一章实验室及基本操作,第一节组织培养实验室的建立第二节植物组织培养的一般技术,第一节组织培养实验室的建立,在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,一、组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察二、构成化学实验室（洗涤室）接种室无菌培养室灭菌室细胞学观测室（可以不设）,三、主要单元功能介绍,接种室(外设缓冲间),无菌接种箱,1.无菌操作室材料的消毒、接种，继代。内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间，放置拖鞋、工作服、工作帽等。,2.培养室满足材料的生长（光、热、水、气）。要求：保温隔热；控温、控光；暗室。设备：培养架、加温设备、降温设备,3.化学实验室器皿的洗涤、干燥、保存；药品称量、溶解、培养基的配置；植物材料预处理，培养材料的观察分析。主要设备工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器。,4.灭菌室对培养基进行灭菌。5.细胞学实验室培养材料的分析照相，设备：显微镜、解剖镜、染色设备。,基本实验室布局平面图,实验台,搁架,培养架,培养架,培养架,培养架,药品及仪器柜,无菌台,无菌台,搁架,拉窗,冰箱,搁架,水槽,电炉,门,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,准备室,缓冲室,无菌室,培养室,四、常用仪器设备,（一）仪器1.天平1/10、1/100药物天平：大量元素、蔗糖、琼脂。1/10000分析天平：维生素、激素、微量元素、微量附加物。2.灭菌锅3.烘箱（干燥箱）80-100：烘干物品、测定植物组织干物质重。150-160：干热灭菌（不超过175）；,4.冰箱有机试剂和母液的储藏；细胞及其他材料的冷藏保存；植物材料的处理（低温打破休眠）。5.酸度计对培养基pH值进行调整。（一般用pH4-7的精密试纸代替）,6.双筒实体显微镜（解剖镜）茎尖的剥取（分生组织）；对植物材料的隔瓶观测。7.蒸馏水器减小实验中的偶然因素。8.空调温度变化差异不大。,蒸馏水器,9.震荡培养机和旋转培养机液体培养。10.培养箱,摇床,光照培养箱,1.玻璃器皿培养器皿原则：无毒透光；试管：215，2.515，315。三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于继代培养）培养皿：原生质体、游离细胞、花药等的培养；无菌种子的萌发；材料的分离；无菌滤纸的消毒灭菌封闭物防止培养基干燥和杜绝污染、无毒透气（棉塞、菌膜）,（二）必要器皿,盛装器皿烧杯、试剂瓶，药品的溶解和储存。计量器皿量筒：10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。移液管：0.1ml，0.2ml，1ml，2ml，5ml，10ml。其他漏斗玻棒滴瓶,2.金属器皿,镊子：剪刀：分离器械：手术刀、芽接刀,大量元素；微量元素；维生素、氨基酸等（有机附加物）。糖类：蔗糖、葡萄糖等。凝固剂：琼脂等。激素生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D。细胞分裂素类：6-BA、KT、ZT赤霉素类：GA3,（三）常备药品,一、培养基及其配制（一）概念培养基：外植体生长的营养物质。（二）种类1.根据水平基本培养基大量元素和微量元素、维生素和氨基酸，还有糖和水。完全培养基在基本培养基的基础上，附加植物生长调节剂或有机附加物。,MS+NAA0.2+6-BA2+蔗糖3%+pH5.8,第二节植物组织培养的一般技术,单位：mg/L,2、根据成分天然培养基：动、植物的组织或组织的汁配成的培养基。化学成分还不清楚或不恒定。生物性液体（血清）；组织浸液（胚胎浸液）；凝固剂（血浆）等。合成培养基：成分、浓度已知。半合成培养基：天然培养基+合成培养基。3、根据理化状态液体培养基固体培养基：液体培养基+凝固剂。,4、根据功能愈伤组织培养基、花粉培养基、茎尖培养基、脱分化培养基、增殖培养基、分化培养基。1）脱分化培养基（mg/L）高浓度生长素烟草：MS+水解蛋白500+2,4-D1-2。水稻：MS+2,4-D1。多量生长素+少量细胞分裂素烟叶：MS+水解蛋白500+2,4-D2+KT0.25哈密瓜：Miller+NAA2+KT0.5多量细胞分裂素+少量生长素天竺葵：MS+NAA0.2+6-BA2,2）继代培养基在脱分化培养基上降低生长素的量、或用原脱分化培养基。3）生根培养基只用基本培养基；加生长素：菠萝：MS+IAA0.3加细胞分裂素：哈密瓜：Miller+KT0.5半量法,（三）培养基成分功能组成各种化合物，参与机体的建成，成为结构物质。构成一些生理活性物质，参与活跃的新陈代谢。元素之间互相协调，以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用。注：不同器官的发生，需要营养元素的浓度不同。,1.无机盐大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、钾、钙、镁、硫、硅（-）。3+7种，干重0.01-10%微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、氯、镍（-）、钠（-）。9种，干重0.00001-0.01%I（+）、Co（+）。必需元素的生理作用，略。,2.有机物1）维生素：B1（盐酸硫胺素）、B3（烟酸）、B6（盐酸吡哆醇）。维生素主要是以各种辅酶的形式参加酶的形成，以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。对生长和分化有促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入1至数种维生素，以便获良好的生长.。,2）氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源，可直接被细胞吸收利用。常用的有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。用酶法等加工牛乳的水解产物，由于营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,3）肌醇肌醇具有帮助活性物质（VB1）发挥作用的效果，能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的促进作用。4）天然有机附加物大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，与其成熟度及产地关系也很大，所以一般应尽量避免使用。,椰乳：是使用最多、效果最好的一种天然复合物。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用。香蕉：用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮，再经过过滤，取其滤液使用。对pH值缓冲作用也大。酵母提取液：主要成分为氨基酸和维生素类。其他，麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,3.碳源为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，还可以维持一定的渗透压。最常用的碳源是蔗糖。葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。浓度：2%-4%，最常用3%。在大规模生产时，可用食用的白糖代替。,4.植物生长调节剂1）生长素类诱导细胞脱分化，促进愈伤组织的形成；促进细胞伸长生长和细胞分裂；促进生根。吲哚乙酸：激素，有利于根形成，但是它容易被氧化和光解，组织培养中通常使用合成的生长素。吲哚丁酸：诱导许多植物生根。萘乙酸：最适宜诱导愈伤组织或诱导某些外植体生根。二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起脱分化。能够引起染色体变异，因此使用时必须格外小心。,2）细胞分裂素类促进细胞分化；有利于细胞分裂和愈伤组织的形成；促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，而抑制茎的伸长；诱导芽的分化，促进侧芽发生。激动素：最主要的用途是诱导芽的形成。玉米素：是一种天然激素，价格昂贵，其作用稍差于苄氨基嘌呤。6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，是组织培养最常用细胞分裂素类。主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。,3）赤霉素赤霉素有127种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进胚状体发育成小植株。,5.培养材料的支持物琼脂固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在0.8-1.0%之间。凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间和pH值等因素有关。其它：玻璃纤维、滤纸桥、海绵、卡拉胶等。,6、其他成分抗生素物质：有青霉素、链霉素、庆大霉素等,可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。抗氧化剂：易褐化的材料。活性炭：茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长；活性炭在生根时有明显的促进作用。7、pH值喜光、耐旱、耐盐碱：pH值中性；喜湿、耐阴、喜酸：pH值偏酸。培养基灭菌后，pH值一般下降。,（四）培养基的选择几种基本培养基的特点1）富集元素平衡培养基-MS培养基（典型代表）无机盐浓度高，元素间的比例较适合；缓冲性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡；营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机成分；微量元素种类较全，浓度较高；适合多种植物，用途广泛。与MS相类似的培养基，LS、BL、BM、ER培养基等。,2）硝酸钾含量较高的培养基硝酸钾的含量高，铵态氮的含量低，含有较高的盐酸硫胺素（VB1）。如，B5（水稻成熟胚愈伤组织分化时用其微量元素部分）、N6（禾谷类植物的花药和花粉培养）、SH培养基。,3）中等无机盐含量的培养基大量元素无机盐约为MS的一半；微量元索种类减少而含量增高；维生素种类比MS多。如，H、Nitsch、Miller培养基。4）低无机盐培养基无机盐含量很低，一般为MS的1/4；有机成分含量也很低；多用作生根培养基。如，White、WS、HE、HB培养基。,2.培养基选择1）背景调查对该供试植物分类地位、生理特性、繁殖、栽培条件及品种类型等有充分的了解。应详细查阅前人对该植物的研究工作，总结分析前人工作的成功和不足之处，从而在此基础上确定基本培养基类型。,2）选择原则同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；同一植物的不同组织、器官的基本培养基类型基本相同；营养成分需求与田间栽培有相似性；无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参数；有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大；在确定基本培养基类型后，研究最适的蔗糖浓度。,3）激素的选择原则生长素主要功能是促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根等，各种生长素的强度按以下排列而减弱：2,4-D、NAA、IBA和IAA。与细胞分裂素互作促进茎的增殖。细胞分裂素主要促进细胞分裂，改变顶端优势，促进芽的分化等。常用几种细胞分裂素的强度按以下排列减弱；ZT、6-BA、KT和腺嘌呤。,激素选择原则细胞分裂素与生长素的比例是激素使用的关键；细胞分裂素与生长素的种类对不同植物的敏感性不同；同一植物的不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素的要求不同。,4）常用试验方法单因子试验培养基中其他成分都不变，只变动一个因子。就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究。试验可采用完全试验方案、正交设计方案。,培养基配方试验,2.母液配制1）优点减少工作量;减少多次称量造成的误差;便于微量元素的称量;保证每一个材料的培养基有相同的成分。,2）母液种类大量元素：1050倍；微量元素：100200倍；Fe盐：100200倍（棕色瓶）；有机物：20100倍；植物生长调节剂母液（1mg/ml）。,3）母液配制注意事项植物生长调节剂的溶解生长素类：碱溶；95%乙醇溶、蒸馏水定容。细胞分裂素类：酸溶、蒸馏水定容。赤霉酸：热水溶，以95%乙醇配成原液。,3、培养基配制蒸馏水母液生长调节剂琼脂粉蔗糖融化调节pH分装灭菌冷却,二、无菌技术,有菌的范畴凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。无菌的范畴经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体，高层大气、岩石内部、强酸强碱，化学元素灭菌剂等的表面和内部等等都是无菌的。,污染指在组织培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。直接侵入培养物中，杀死培养物；向培养基分泌有毒物质，毒死培养物；竞争培养基养分使营养耗尽，培养物饥饿而死。,污染所引起的危害污染引起的危害有的是极明显的，如早期培养的失败，增殖效率的降低，生长减慢，玻璃苗增加，生长的不均匀等；而有的影响可在以后的过程显现，如移栽困难和苗的死亡，田间的不良表现。污染也会引起培养物的遗传变异。有些病原菌的存在（如国际上已发现的某些商业生产的试管苗带有胡萝卜软腐欧文氏菌），可以引起多种作物的病害；试管苗（在未进行专门的病原体脱除和鉴定时）也常是很多致病的病毒、类病毒、类菌原体的携带者，育目发展可能引起病毒大规模的扩散。,（一）污染源及其表现特征,1.外植体表面带菌：接种后很快长出微生物菌落;内生带菌：接种后一定时间才表现出来。特征：靠近外植体培养基表面出现微生物菌落。2.培养基在培养基表层和深层同时出现点状分布的菌落。,3.培养器皿在培养基与容器接触处或器壁上出现菌落。4.工作人员在培养基表面或操作器械接触处出现菌落。5.空气原因：超净工作台故障；瓶塞过松特征：在培养基表面靠近培养容器壁处出现菌落。,（二）常用的灭菌方法灭菌用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。,1.加热灭菌1）湿热灭菌设备：高压灭菌锅原理：通过蒸汽接触材料表面冷凝时释放热能达到杀死微生物的目的。工作条件：1-1.2kg/2，20-30min。121，15min。注意事项灭菌前排尽冷空气；灭菌后压力切勿降低太快。,2）干热灭菌灼烧蘸95%酒精燃烧器具。烘烧设备：烘箱工作条件：140，4h或160-170，2-3h注意事项：要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染；温度一般勿超过175,2.化学灭菌1）液体灭菌：酒精、升汞、双氧水、次氯酸钠等，适用于外植体表面灭