EV71实验室早期诊断研究进展-马英伟1.22.docx

肠道病毒71型感染的早期快速检测研究马英伟，温红玲，王志玉山东大学 济南 25000摘要 手足口病（HFMD）是一种常见的传染病，可引起手、足、口腔等部位的皮疹及疱疹1。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见。手足口病患儿病情多数轻微，但是EV71病毒感染可致重症手足口病。能引起无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关疾病。EV71感染的早期诊断对患儿的预后很重要20世纪90年代后，EV71的感染引起了亚太地区婴幼儿神经源性肺水肿的多次发生，其中甚至有死亡病例的报道，给公共卫生领域提出了巨大的挑战。所以，亟需找到EV71的特异性检测方法，一旦发现EV71的感染，应采取积极有效的治疗策略，防止神经及呼吸系统并发症的出现，挽救重症患儿的生命，所以病原体的早期快速检测至关重要。目前病原体的检测方法包括病毒的分离培养法、逆转录聚合酶链反应、EV71中和抗体测定法、EV71-IgM胶体金免疫层析法、EV71抗体酶联免疫吸附法、补体结合试验、基因芯片技术等。其中病毒分离培养法是临床诊断EV71感染的金标准，但该法工作量大，耗时长，不能为临床上手足口病的诊断和治疗提供即时参考。EV71中和抗体测定法及补体中和试验也因耗时长，试验步骤繁琐而不利于早期诊断。本文旨在介绍目前几种常用的EV71早期快速检测方法。关键词 手足口病，肠道病毒71型，快速检测The rapid detection of early stage infection of Enteroviruse 71Yingwei Ma, Hongling Wen, Zhiyu WangShandong University, Jinan, 25000Abstract 对照中文摘要进行修改HFMD is a common infectiou disease which can cause rash and herpes on hand,foot and mouth.There are more than 20 kinds of virus which can cause HFMD,among them EV71 and CoxA16 are the most common pathogens.The symptom of patients with HFMD are mild except the ones caused by EV71. They can develop with Aseptic meningitis, encephalitis polio-like paralysis and even other nervous system-related diseases. After the 1990s, EV71 infection caused several cases of infants neurogenic pulmonary edema in Asia-Pacific region. It has even been reported several cases of deaths in that region, which poses a huge challenge to public health . Therefore, we need to find a specific detection method of EV71, once the EV71 infection is found, we should take positive and effective treatment strategies to prevent neurological and respiratory complications, saving the lives of children with severe infection. So the early rapid detection of pathogens is of great importance .Nowadays the detection of pathogens including viruses isolated culture, reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR), EV71 neutralizing antibody assay, EV71-IgM colloidal gold immunochromatography, EV71 antibody enzyme-linked immunosorbent assay, complement fixation test, microarray technology. Among all the virus isolation method is the clinical gold standard for the diagnosis of EV71 infection, but this method is time-consuming, so it can not make immediate clinical diagnosis and help to treat the patients with HFMD. EV71 neutralizing antibody assay and complement fixation test are also time-consuming and tedious.So they cannot be used for early diagnosis. This article aims to introduce several rapid detection of early stage infection of EV71. And lay the foundation for early diagosis of EV71.Key words Hand-Foor-Mouth Disease, Enteroviruse 71, rapid detection手足口病（HFMD）是一种常见的传染病，可引起手、足、口腔等部位的皮疹及疱疹1。2008年以来，我国多个省份大规模爆发手足口病，并有死亡病例的报道，所以我国卫生部于2008年5月2日将其列为丙类传染病。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见2、3。手足口病患儿病情多数轻微，但是少数患儿可出现中枢神经系统和呼吸系统损害，引发脑炎、急性迟缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等；并发神经系统及呼吸系统疾患的重症患儿病情进展迅速，病死率较高4、5。有研究发现，重症手足口病患者大多数为EV71病毒感染所致6、7、8、9，肠道病毒71型（EV71）属于肠道病毒A，是小RNA病毒。EV71病毒自1969年首次报道以来，已经引发全球范围内的10多次爆发与流行。EV71感染不仅能够引起婴幼儿手足口病，也能引起无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关疾病。20世纪90年代后，EV71的感染引起了亚太地区婴幼儿神经源性肺水肿的多次发生，其中甚至有死亡病例的报道，给公共卫生领域提出了巨大的挑战10。早期诊断和积极治疗对于EV71感染患儿的预后非常重要。查一下文献，最好是能有相关的文献支持。所以，亟需找到EV71的特异性检测方法，一旦发现EV71的感染，应采取积极有效的治疗策略，防止神经及呼吸系统并发症的出现，挽救重症患儿的生命，所以病原体的早期快速检测至关重要。目前病原体的检测方法包括病毒的分离培养法、逆转录聚合酶链反应、EV71中和抗体测定法、EV71-IgM胶体金免疫层析法、EV71抗体酶联免疫吸附法、补体结合试验、基因芯片技术等。其中病毒分离培养法是临床诊断EV71感染的金标准，但该法工作量大，耗时长，不能为临床上手足口病的诊断和治疗提供即时参考。EV71中和抗体测定法及补体中和试验也因耗时长，试验步骤繁琐而不利于早期诊断。本文旨在介绍目前几种常用的EV71早期快速检测方法的研究进展。1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）RT-PCR是近年来发展的一种将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛11，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等，也可以用于肠道病毒的检测和鉴别诊断。例如，鉴别EV71和CoxA16的感染，将分离完成的病毒进行RT-PCR扩增，最后使用限制内切酶Taq I和EcoT22 I进行酶切，CoxA16产物能被酶切而EV71产物无法被酶切，可以将两种病毒鉴别为什么没引用参考文献呢？。也有研究提出使用EV71和CoxA16病毒特异性引物进行常规多重RT-PCR扩增并联合基因芯片技术来区分两种病毒。该法使用RT-PCR法扩增EV71和CoxA16 VP1基因，将扩增子进行荧光标记并加到点有EV71和CoxA16的核苷酸探针阵列芯片上，通过探针的特异性结合进行病毒的分型鉴定参考文献？。PCR法与病毒分离培养法及血清学检测方法相比，具有较好的敏感性、特异性和较高的检出率，是临床上EV71检测最常用的方法。目前研究多使用实时荧光定量PCR技术，荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用累积的荧光信号，对整个PCR进程实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。比传统的PCR技术具有更高的敏感度和特异性12。Thao NT等13和李丽琴等16提出了双重及四重实时荧光定量PCR诊断试剂盒，能够同时鉴别EV71、CoxA16及通用型肠道病毒。 实时荧光定量RT-PCR技术具有更高的敏感性和特异性，该法不需要扩增后处理，避免了PCR污染问题，自动化程度高，重复性好，在病原诊断应用方面越来越广泛14。但是此法对实验室要求较高，成本大，实验周期较长，而且基层医院因条件限制无法开展15，且不能避免假阴性和假阳性问题16。2 EV71-IgM胶体金免疫层析法 EV71-IgM胶体金法采用捕获法的原理，检测人血清，血浆以及全血样本中的EV71-IgM15。将特异性的EV71抗原以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合点上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，显示出肉眼可见的颜色变化。该方法操作简单迅速，不需要特殊仪器及设备，适合各级医院（包括基层医院）的早期诊断，能够实现EV71感染的早发现、早治疗和及时防控，对于重症手足口病的防治具有重要意义。但是胶体金法也存在缺点，因为该法依赖于检测特异性IgM抗体，而在临床中有个别感染患者，体内不产生抗体或者仅产生少量抗体，致使最终出现阴性结果15，所以对于临床上带有明显症状的可疑病例应该采用RT-PCR法进行确认。 3 EV71抗体酶联免疫吸附法将酶标的EV71抗原结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。将受检样本和酶标抗原与固相载体表面的抗原起反应，加入酶的反应底物，产生有色产物，有色产物的量和标本中受检物质的量直接相关，可以根据颜色深浅进行定性或者定量分析。国内有学者建立了一种EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫（BA-ELISA）检测方法，该法以抗EV71抗体作为包被抗体，使用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA法。该方法能够消除EV71和CoxA16两种病毒之间的交叉反应，而且能够有效检测出EV71抗原，无其他的交叉反应17。但是BA-ELISA法在保证特异性的基础上，检测的灵敏度低于RT-PCR法及细胞培养分离法。但已有学者提出，如果能够得到更高效价的抗血清或者单克隆抗体，或者进一步提高EV71抗原纯度，则此法的灵敏度也会显著提高17。捕获ELISA法测IgM抗体是最常用的方法，但是该法洗板和酶标仪读数时容易受到外界的影响18。目前ELISA检测方法是以表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原，成功开发了ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒，既能够检测急性感染期患儿血清中的IgM，也能检测曾感染EV71患儿血清中的抗IgG，而且与CoxA16抗血清无交叉免疫反应。但是抗-EV71 IgG在部分非EV71型手足口病患儿急性期或者健康儿童中阳性，这是由于既往感染存在免疫保护的可能性。ELISA法操作简单迅速，能够实现EV71感染的早发现。 4 基因芯片技术这个方法在EV71的检测中有研究的文献报道吗？如果有，应该讲一下进展，如果没有可以去掉。 基因芯片技术是将基因组探针、cDNA探针后显微打印的方式，将数以万计的探针有序的固化到硅片、玻璃片等固相支持物表面，然后与标记的待测样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，来实现对DNA等生物样品的快速、平行、高效的检测。由于该技术可以将成千上万的探针同时固定于支持物表面，所以经过一次杂交实验就可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blot和Northern Blot等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。基因芯片技术能同时平行检测多个基因，准确性和特异性强，能够避免假阳性和假阴性。但是该法技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性较差、分析范围较狭窄等。综上所述，目前已发展了几种方法用于EV71的检测，胶体金免疫层析法、ELISA方法属于快速检测法，有利于在基层医疗单位中开展，ELISA法与胶体金法相比，操作较复杂，结果容易受到外界影响19。更有研究表明，对于手足口病发病初期的患儿胶体金免疫层析法检测的阳性率高于酶联免疫法，因此，为防止临床上的漏诊率，胶体金免疫层析法要优于酶联免疫法20。或者将EV71-IgM酶联免疫法与EV71核酸检测法联用能够提高诊断率。由于肠道病毒EV71的感染存在隐性感染，这给疾病的防治都带来了困难。目前常用的实验室诊断方法中，包括免疫学方法、病毒分离培养法和PCR方法等，均存在难以早期诊断、敏感度低的缺陷。免疫学方法如EV71中和抗体测定法、EV71-IgM胶体金免疫层析法和ELISA法等，是检测血清中的抗体，而抗体产生有一定的滞后，使得免疫学方法不能在患病早期得到相应的结果，敏感性相对较低，延误病情。病毒分离的方法虽然准确，但其操作的繁琐性及复杂性延误了最佳诊断时机。PCR方法虽不存在这个问题，但易出现假阳性结果。因此，都不能实现有效确诊的早期诊断。因此今后需进一步完善手足口病病原体检测技术，特别是快速、准确、操作简单、成本低廉的检测技术。参考文献： 1 Li Wei Ang,Benjamin KW Koh,Kwai Peng Chan,et al.Epidemiology and Control of Hand, Foot and Mouth Disease in Singapore, 2001-2007J.Ann Acad Med Singapore 2009;38:106-12.2 杨建新，陈大放，杨鲁明，等2012年南宁市良庆区手足口病流行特点及病原学特征分析J广西医科大学学报，2013，30（3）：473-474.3 Mei-Liang Huang, Pai-Shan Chiang, Shu-Ting Luo,et al.Development of a high-throughput assay for measuring serum neutralizing antibody against enterovirus 71. 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