第二章 酶促反应动力学

.,第一章酶促反应动力学,魏春,.,课程主要内容,第一章酶促反应动力学(4)酶促反应动力学特点；酶促反应动力学基础；米氏方程；竞争性抑制酶促反应动力学；非竞争性抑制酶促反应动力学；产物抑制酶促反应动力学；底物抑制酶促反应动力学；多底物酶促反应动力学；酶的失活动力学第二章微生物反应动力学(6)影响微生物生长和代谢的各种因素,微生物反应过程计量学,得率系数，比生长速率概念及计算,微生物生长的非结构模型，基质消耗动力学,产物合成动力学第三章微生物反应器操作(5)微生物反应器操作的分类及比较分批式操作：生长曲线及状态方程式流加式操作：流加操作的分类、指数流加数学模型连续式操作：连续操作存在的问题及应用,.,第四章动植物细胞培养动力学(2)动植物细胞培养的特性，植物细胞培养及反应动力学，动物细胞培养及反应动力学第五章生物反应器中的传质过程(4)流体流变学特性,发酵液的流变学特性,氧传递理论，体积溶氧系数的测定,影响kLa的因素及其提高措施第六章生物反应器(3)生物反应器设计基础，常见的生物反应器,生物反应器放大的目的与方法第七章生物反应工程领域的拓展(6)超临界生物反应，双液相生物反应、代谢工程、系统生物学等生物应工程领域的拓展介绍,.,引言：碱性果胶酸裂解酶活力测定取适量稀释一定倍数的粗酶液和2ml1%(w/w)果胶溶液(pH9.6)分别置于两个试管中，于55水浴预热5min，然后吸取1ml粗酶液加入到果胶溶液中，并使它们充分混匀，准确反应10min。取上述反应混合物1ml加入9ml0.01mol/lHCl终止反应，在235nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照。一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1mol的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-1。U=（A/4600）10610-3310（1/10）n=An(30/46)式中：U-酶液的酶活力，U/mLAOD值n酶液稀释倍数,.,2.1酶促反应动力学的特点,2.1.1酶的基本概念2.1.2酶的稳定性及应用特点酶是以活力、而不是以质量购销的。酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。,.,经典酶学研究中，酶反应速率的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。,.,2.2均相酶促反应动力学2.2.1酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。,.,一步简单反应,（1）,对（1）式从0-t（CA0到CA）进行积分可得,.,2.2均相酶促反应动力学2.2.1酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。对酶促反应，有：,式中，k：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率(P指C或D)。,CA不断减少，为使rA恒为正，所以式前要加负号,.,对连锁的酶促反应，,.,2.2.2单底物酶促反应动力学2.2.2.1米氏方程根据酶底物中间复合物假说，对单底物酶促反应，其反应机制可表示为：,.,快速平衡法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑产物P的可逆反应。（3）为快速平衡，为整个反应的限速阶段，因此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。,.,解之，得,令,则,根据假设建立动力学方程,.,稳态法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。（3）CSCE中间复合物ES一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物ES浓度保持衡定，即。,.,解之，得,令,则,根据以上假设，可建立如下方程组,.,米氏方程,图21酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响,.,对米氏方程的讨论：当CSKm时，属零级反应。当CSKm时，。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。,.,引言：碱性果胶酸裂解酶活力测定取适量稀释一定倍数的粗酶液和2ml1%(w/w)果胶溶液(pH9.6)分别置于两个试管中，于55水浴预热5min，然后吸取1ml粗酶液加入到果胶溶液中，并使它们充分混匀，准确反应10min。取上述反应混合物1ml加入9ml0.01mol/lHCl终止反应，在235nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照。一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1mol的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-16。U=（A/4600）10610-3310（1/10）n=An(30/46)式中：U-酶液的酶活力，U/mLAOD值n酶液稀释倍数,.,双倒数法(LinewearBurk):对米氏方程两侧取倒数，得,以作图，得一直线，直线斜率为，截距为,根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。,.,图22双倒数法求解Km和rmax,.,习题,将底物1g/L和酶0.001mol/L加入到酶反应器中，经反应，底物转化率为90%时，反应时间是多少？已知反应速率方程为,.,2.2.2.2抑制剂对酶促反应速率的影响失活作用:使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用不可逆抑制竞争性抑制可逆抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,.,竞争性抑制非竞争性抑制,.,竞争性抑制：抑制剂与底物竞争，从而阻止底物与酶的结合。因酶的活性中心不能同时与抑制剂(I)作用，又与底物(S)作用。竞争性抑制剂具有与底物相类似的结构，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解成产物P。非竞争性抑制：酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。但是ESI复合体不能进一步分解为产物，因此酶活性降低。,.,竞争性抑制反应机理：,.,快速平衡法推导动力学方程：,解之，得,，,式中:,.,采用稳态法推导动力学方程：,.,解之，得,式中:,.,非竞争性抑制反应机理,.,快速平衡法推导动力学方程,解之，得,式中:,.,稳态法推导动力学方程：,.,解之，得,式中:,.,竞争性抑制非竞争性抑制,令,可变形为:,可变形为:,令,.,竞争性抑制非竞争性抑制,CI=0,CI,.,产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。,反应机理：,.,快速平衡法推导动力学方程:,.,解之,得,式中:,.,稳态法推导动力学方程:,.,解之,得,式中:,可见,产物抑制属于竞争性抵制,.,底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。,CS,.,底物抑制反应机理：,.,快速平衡法推导动学方程：,.,解之,得,式中:,.,2.2.3多底物酶促反应动力学,.,一般的多底物酶促反应可表示为：,这里讨论：双底物双产物情况,.,反应机制：,关键问题：底物A、B哪个先和酶结合？任何一个都有可能先与酶结合（随机机制）A先与酶结合或B先与酶结合两底物同时与酶结合（可能性极小）,.,随机机制（分支机制）,.,（不形成三元复合物）反应模型,EA,E,A,A,P,P,B,B,EQ,Q,Q,E,EG,（EG：修饰过的酶）,.,简单机制,.,双底物酶促反应动力学反应机理：,.,.,解之，得,式中：,.,2.3固定化酶促反应动力学,2.3.1固定化酶促反应动力学基础2.3.1.1酶的固定化技术定义酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固相酶的技术。细胞的固定化技术:为省去从微生物（或动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植物细胞、组织技术。,.,物理吸附法载体结合法离子结合法共价结合法交联法格子型包埋法微胶囊,2.3.1.2酶和细胞固定化方法,.,交联法,.,2.3.1.3固定化对酶性质的影响,底物专一性的改变稳定性增强最适pH值和最适温度变化动力学参数的变化,.,2.3.1.4影响固定化酶促反应的主要因素,分子构象的改变位阻效应微扰效应分配效应（可用Kp定量描述）链接扩散效应（可定量描述）,.,分配系数(Kp)链接,分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。Kp的测定：已知底物浓度(CS0)，体积(V0)的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)。,.,2.3.2固定化酶促反应过程分析,2.3.2.1外部扩散过程以表面固定化酶为例。,CS,CSS,.,外扩散过程分析,外扩散速率：,达到平衡时，,即,酶促反应速率：,.,.,Da准数:,当时，过程为外扩散控制。当时，过程为反应控制。,.,式中:,表明C*为Da准数的函数，即,.,(时,),表明,为C*的函数，即,.,可见，Da准数是决定效率因子和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，越小，越趋近于零。,.,为提高固定化酶外扩散效率,应设法减小Da准数。减小Da准数的措施：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大。,.,2.3.2.2内部扩散过程,具有大量内孔的球形固定化酶颗粒,R,dr,r,内扩散效率因子,.,稳定状态下，对底物进行物料衡算：,流入量流出量反应量,.,整理,得,两侧同除,得,.,当反应符合米氏方程规律时，,故,令,上式可转化为无因次形式，得,.,边界条件:,该微分方程无解析解，只能用数值法求解。,.,西勒准数(),的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的的定义式为:,.,引入无因次参数，则,无解析解，只有数值解。,.,见教材33页图2-10,内扩散效率因子in是和的函数。对in影响不大，影响in的主要参数是西勒准数。如果，则不随变化，近似等于1，也就是说没有内部传质阻力，若，则，反应为内扩散所限制。,.,为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小。减小的措施主要是适当降低固定化酶颗粒粒径。,.,.,2.4酶的失活动力学,.,2.4.1未反应时酶的失活动力学,2.4.1.1一步失活模型式中:E具有活性的酶，D失活的酶。kd失活反应速率常数。,.,建立酶失活动力学方程：,边界条件：积分，得,.,几个概念：,：一步失活常数：半衰期，当：时间常数，三者关系：,.,2.4.1.2多步失活模型,多步串联失活模型：同步失活模型：式中，为失活