第七章 核酸分子杂交技术与核酸序列测定

.,第七章核酸分子杂交技术与核酸序列测定MolecularHybridizationandBlottingTechnology主讲教师：熊伟副教授/博士,.,ContentofTable,前言1核酸分子杂交技术的原理2核酸探针的制备3核酸探针的标记4核酸分子杂交技术,.,前言,.,核酸分子杂交把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。,.,第一节核酸分子杂交的基本原理,.,（一）核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理P44,.,复性,RNA,DNA,.,1.原理DNA的变性与复性2.常见条件：加热S形曲线解链温度（Tm）A260增高的原因3.分子杂交的目的,.,应用：(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。,Home,.,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,.,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。,.,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,.,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。,.,DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,复性条件：Tm50C4度以下几乎不复性,.,.,核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,.,第二节核酸探针技术及其标记,探针(probe)P46经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。,.,一、核酸探针的种类和应用,根据核酸性质和检测目的不同可以分为：（一）基因组DNA探针（二）cDNA探针（三）RNA探针（四）人工合成的寡核苷酸探针最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之间在核酸序列上要有高度的特异性,.,基因组DNA探针,真核生物基因组中存在大量的重复序列和非编码序列，因此选择基因组DNA做探针时，一定要充分考虑实验目的性利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段特定的DNA序列,.,cDNA探针,cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产生的。利用基因克隆的方法可获得cDNA优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。,.,RNA探针,RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针。利用mRNA与基因的DNA杂交，可以反映出基因的转录状态。,.,人工合成的寡核苷酸探针,利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成寡核苷酸探针,.,设计寡核苷酸探针的原则,1）序列及长度根据靶分子的序列而定，长度一般为18-50个核苷酸合适。2）碱基成分一般G+C含量为40%-60%3）探针分子内不存在互补，避免出现“发夹”结构4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个5）与非靶标区域的同源性不超过70%,.,二、探针的标记,探针标记方法:放射性和非放射性两种放射性核素：32P、35S和3H非放射性标记物：1）半抗原：生物素、地高辛素抗原-抗体反应2）配体：生物素-亲和素反应3）荧光素(FITC、罗丹明)4）化学发光探针,.,探针标记方法,核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标记，分为化学法和酶法化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。,.,一个理想的标记物应满足：(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。,.,常用探针的标记方法,3.2.1缺口平移法3.2.2随机引物标记法3.2.3末端标记法3.2.4生物素光照标记法,.,缺口平移法的原理,将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的53的聚合酶活性和53的外切酶活性相结合。首先用E.coli的DNAseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNApolI的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。,.,随机引物标记法原理,用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。,.,末端标记法原理,（1）一种是在5末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP的-磷酸转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。,.,生物素光照标记法,光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。,.,探针的纯化,1.乙醇沉淀法用无水乙醇沉淀2-3次2.SG-50柱层析法3.微柱离心法,.,第三节核酸分子杂交的基本方法,核酸分子杂交根据被分析样品的性质不同，分为：液相杂交和固相杂交。固相杂交：液相中的核酸探针与位于固相支持物上的待测核酸片段进行杂交的过程。分为：原位杂交印迹杂交,.,印迹杂交将通过凝胶电泳分离的核酸片段转移到特定的固相支持物上,在转移过程中，核酸片段保持其原来的相对位置不变，然后采用标记的核酸探针与结合于固相支持物上核酸片段进行杂交的技术。,.,印迹杂交类别：（一）DNA印迹技术(Southernblotting)（二）RNA印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting),.,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,从组织或细胞中提取基因组DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳将DNA按大小分离含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性DNA变性后从凝胶转移到固相支持物上特异性探针与固着于膜上的DNA杂交杂交结果反映待测核酸样品的有关基因信息。,.,分子杂交实验,.,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,.,。,.,真空转膜,.,.,.,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,.,Southern和Western印迹法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAbyblotting,32P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamidegel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washtoremoveunboudantibody,Proteinbanddetectedbyspecificantibody,Autoradiography,.,（二）RNA印迹技术(Northernblotting),基本过程与Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。,.,（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting),将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫印迹技术。靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。,.,实验操作1细胞裂解物的准备；2细胞裂解物的蛋白定量；3细胞裂解物的SDS-PAGE；4蛋白质的转移；5目的蛋白质的检测。,蛋白质免疫印迹法,.,三种印迹技术的比较,.,.,放射自显影照片,.,(四)斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,Dotblottingandslotblotting,适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。,.,(五)原位杂交insituhybridization,分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交,.,第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis,.,基因测序是确定DNA双股链上每个独立结构单元或碱基的确切顺序的过程。测序经常被称为“破译”，因为其结果就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4种字母的序列。这些字母表示4种不同的碱基，分别用它们的首字母A、T、C、G表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生命指令。,生物信息学(bioinformation)是一门伴随着基因组研究而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理以及对这些数据的应用。,.,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法(Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法(sanger法),.,DNA测序的基本战略,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。酶法测序技术进展,.,DNA序列分析（一）双脱氧终止法英国Sanger1955确定牛胰岛素结构,1958获诺贝尔化学奖1975设计出DNA测序法,1980获诺贝尔化学奖.合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,.,.,.,.,DNA的Sanger测序法(酶法),dNTP,反应混合物,Klenow酶,未知序列的单链DNA,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,.,DNA的测序仪示意图,computeranalysis,凝胶中DNA移动方向,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,.,测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记毛细管电泳,单色荧光标记平板电泳,同位素标记平板电泳,A,C,G,T,测序图谱,TA