第四章抗体PPT课件

第四章抗体(Antibody，Ab),抗体(antibody，Ab)是在抗原和免疫系统相互作用下由B细胞产生的能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。1964年WHO决定将具有活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。,Ig,一、免疫球蛋白的结构,（一）Ig的基本结构Ig的基本结构是由二硫键连接起来的四条多肽链组成的一个Ig的单体分子。,N端,C端,（一）Ig的基本结构,1、重链和轻链重链约有450570个氨基酸残基。每条H链含有45个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和他们的位置、所含的种类和数量不同，其抗原性也不相同。,1、重链和轻链,根据H链抗原性的差异可将其分为五类，不同的重链分别以希腊字母(gamma)、(alpha)、(mu)、(delta)和(epsilon)表示，不同H链与L链组成完整Ig的分子分别称之为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。,五种Ig的结构示意图,1、重链和轻链,轻链约有212个氨基酸残基，有(Kappa)和(Lambda)2型。每个Ig分子的两条轻链总是同型的。人血清中的:约为2:1。每条轻链含有两个链内二硫键内二硫所组成的环肽。,2、可变区与恒定区,Ig的氨基端（N-末端）轻链的1/2（约含108111个氨基酸残基）与重链的1/5或1/4区段（约含118个氨基酸残基）的氨基酸组成及排列顺序多变称为可变区（variableregion,V区）。,2、可变区与恒定区,而羧基端(C端)轻链的1/2与重链的3/4(或IgE的4/5)区域(约从119位氨基酸至C末端)，氨基酸的组成和排列比较恒定，为恒定区(C区)。,H链每个功能区约含110多个氨基酸残基，含有一个由二锍键连接的5060个氨基酸残基组成的肽环。这个区域氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定。,2、可变区与恒定区,2、可变区与恒定区,L链和H链的V区分别称为VL和VH。在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度，这些区域称为高变区(HVR)。,2、可变区与恒定区,经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为决定簇互补区(CDR)。HVR1、HVR2和HVR3又可分别称为CDR1、CDR2和CDR3，一般的CDR3具有更高的高变程度。高变区也是Ig分子独特型决定簇主要存在的部位。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。在V区中非HVR部位的氨基酸组成和排列相对比较保守，称为骨架区（fuameworkrugion，FR）。,Ig的互补决定区与抗原表位结合示意图,轻链的基本折叠,轻链的免疫球蛋白的功能区共有一种基本的折叠模式，几个多肽链的直形片段和结构域（功能区）的长轴平行。轻链有二个功能区：VL和CL。在每个功能区中多肽链排列为两层，彼此方向相反，在两层之间有许多疏水氨基酸。两层中的一层具有四个片段（白色箭头），另一层有三个片段（黑色箭头），两者由一个二硫键（红色）相连。VL功能区的折叠使高变区成为三个分离但又紧密位于一起的环。每个高变区都有一个残基编号示出。,3、J链和分泌成分,（1）连接链（joiningchain，J链）存在于二聚体分泌型IgA和五聚体IgM中。J链分子量约为15kD，由124个氨基酸组成的酸性糖蛋白，含有8个半胱氨酸残基，通过二硫键连接到链或链的羧基端的半胱氨酸。J链可能在Ig二聚体、五聚体或多聚体的组成以及在体内转运中的具有一定的作用。,J链,3、J链和分泌成分,（2）分泌成分（secretorycomponent,SC）又称分泌片(secretorypiece)，是分泌型IgA上的一个辅助成分，分子量约为75kD，糖蛋白，由上皮细胞合成，以共价形式结合到Ig分子，并一起被分泌到粘膜表面。SC的存在对于抵抗外分泌液中蛋白水解酶的降解具有重要作用。,IgM和SIgA结构示意图,（二）功能区,用X射线衍射分析法发现，Ig多肽链是由若干折叠成球形结构组成的一种立体构型。每一球形结构是肽链的一个亚单位，约110个氨基酸组成，具有一定的生理功能，故称功能区(或结构域)。在功能区中氨基酸序列有高度同源性。L链有VL、CL两个功能区；IgG、IgA、IgD的重链有VH、CH1、CH2、CH3共四个功能区；IgM、IgE重链则有VH、CH1、CH2、CH3、CH4五个功能区。,Ig的功能区,（二）功能区,VH、VL共同构成抗原结合部位；IgG的CH1能结合补体C4b，CH2能结合补体C1q，CH2加CH3有结合吞噬细胞的作用，与免疫调理作用有关，还与IgG通过胎盘的特性有关；IgE的CH4可同肥大细胞结合，参与I型超敏反应。CH1与CH2之间的区域为绞链区，含大量脯氨酸，对木瓜酶及胃蛋白酶敏感。有弹性，可自由展开至180度，可使Fab段合拢或分开，有利与抗原结合或易使补体结合点暴露。,Ig的绞链区及功能,（三）水解片段,木瓜酶水解IgG分子，可裂解产生两个相同的Fab片段和一个Fc片段。抗原结合片段：含一条完整的L链和重链近N端的1/2，能与抗原特异性结合。可结晶片段：含两条H链C端1/2多肽链，有活化补体等生物学效应。,（三）水解片段,用胃蛋白酶水解IgG分子，可裂解为大小二个片段。即Fab双体称为F(ab)2，功能与Fab段相似。小段类似Fc，可被继续水解成小分子多肽，称为pFc，不再具备任何活性。,Ig的水解片段,二、Ig的抗原特异性,Ig的特征是具有与相应抗原结合的抗体活性，但它也有免疫原性。首先它作为异种蛋白可引起不同种属动物产生相应的抗体。其次，在同一种属不同个体间，由于遗传因素不同就决定了抗体产生细胞遗传性的差异，产生的Ig分子必然具有其遗传标志，即同种异型标志。第三，同一个体内，不同抗体产生细胞克隆所产生的Ig分子也具有不同的抗原特异性，实质上反映抗体产生细胞克隆之间具有遗传上的差异。,二、Ig的抗原特异性,1、同种型（isotype）：在同一种属每个个体都具有的免疫球蛋白的抗原特异性，称为同种型。同种型Ig抗原特异性因种而异，主要存在于Ig的C区。（1）类和亚类：据Ig分子的H链CH抗原特异的差异，可将人、鸡、猪的Ig分为IgA、IgD、IgM、IgG、IgE五类。同一类Ig分子的H链C区抗原特异性仍有差异，借此可将IgG分亚类。如人IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚类。（2）型和亚型：Ig根据L链C区抗特异性不同可分两个型，即和。型轻链C区氨基酸也有差异，又可分亚型。,二、Ig的抗原特异性,2、同种异型（allotype）：同一种属不同个体之间，Ig也有特异性不同的决定簇，因而出现同种异型。主要反映在Ig分子上的CH和CL上的一个或数个氨基酸的差异，它是由于不同个体的遗传基因决定的，故又称为遗传标志。IgG1、IgG2、IgG3重链的遗传标志称Gm因子，有Gm130等30个遗传标志。IgA的2链的遗传标志为Am因子，可将其分为IgA2m1、IgA2m2。型L链的遗传标志为m因子，有m1、m2、m3、等三种。,二、Ig的抗原特异性,3、独特型（idiotype,Id）：在同一个体内，不同B细胞克隆所产生的Ig分子V区有不同的抗原特异性，由此而区分的型别称为独特型。,二、Ig的抗原特异性,三、Ig的理化特性及各类动物的Ig,（一）动物Ig的理化特性,1、IgG为血清中Ig的主要成分，含量最高（在人体中，它占所有Ig的7580%）；IgG为单体分子；半衰期最长：2123天；IgG有抗菌、抗病毒和抗毒素等多种活性，调理、凝集和沉淀抗原。,IgG1,IgG3,1、IgG,它是机体二次反应中产生的主要的Ig，不具备IgG的动物不具有二次反应；IgG在抗体介导的防卫机理中占主要地位，也是唯一可通过人和兔胎盘的Ig。,2、IgM,在大多数家畜血清中含量仅次于IgG。由5个单体组成五聚体，抗原结合价为5价。IgM是抗刺激机体最早产生的Ig分子。IgM的凝集作用及结合补体的能力最强。,如IgM促进吞噬的作用比IgG大5001000倍，杀菌作用大100倍、凝集作用大20倍，但中和毒素、病毒的作用低于IgG。IgM主要存在于血流中，故在防止菌血症方面起重要作用。,3、IgA,IgA有两种类型：血清型IgA主要为单体分子，占IgA总量的85%左右。分泌型IgA为双体分子，存在于唾液、初乳、呼吸道和肠道等外分泌液中。IgA不能激活补体的经典途径，但能激活补体的替代途径。不能作用为调理素，但能凝集颗粒性抗原和中和病毒。,SIgA,分泌型IgA是机体粘膜防御感染的重要因素。在保护肠道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起关键作用。,4、IgE,IgE为单体分子；分子量190kDa，在血清中含量最少，约为0.010.9%；,种系进化中出现最晚；由呼吸道和胃肠道浆细胞产生；,IgE,人和动物血清中浓度很低，但它有独特的Fc区，能结合肥大细胞和嗜碱性细胞，可引起I型超敏反应。IgE还与对蠕虫侵袭的免疫应答有关。IgE在5630min即被破坏。,5、IgD,血清中含量极少，为Ig总量的1%左右。IgD为单体分子，血清中IgD的功能尚不清楚。在B细胞膜上有IgD，为细胞表面抗原受体，有调节B细胞向抗体产生细胞增殖分化的作用。IgD在B细胞膜上出现，是B细胞成熟的标志。这些B细胞都难以产生免疫耐受性，而B细胞膜上只有IgM而无IgD时，容易因相应抗原作用而形成免疫耐受。,五类免疫球蛋白特性比较,五类免疫球蛋白特性比较,五类免疫球蛋白特性比较,（二）主要畜禽Ig的特点,马：IgGa、IgGb、IgG（B）、IgG（T）（orIgT）；IgA、IgM、IgE；牛：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM、IgE；羊：IgG1、IgG2、IgG3、IgA（有两个亚类）、IgE（热不稳定）；猪：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM.IgE.IgD；犬：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE1、IgE2；猫：IgG1、IgG2、IgG3、（IgG4？）IgA1、IgA2、IgM、IgE；鸡：（IgY），IgG（可能有三个亚类）、IgA、IgM和IgE。,四、抗体的生物学活性,（一）特异结合抗原,（二）激活补体系统,Ab(IgM、IgG)+AgC1q补体经典途径；IgG4、IgA和IgE的凝聚物补体旁路途径。,（三）结合Fc受体,(1)介导超敏反应：I型超敏反应；,（三）结合Fc受体,(2)调理作用（opsonization）：IgG+抗原(颗粒性)FcR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）促吞噬细胞吞噬；,（三）结合Fc受体,(3)ADCC：IgG+抗原(靶细胞)FcR（NK细胞）杀伤靶细胞。,四、抗体的生物学活性,五、抗体基因和抗体多样性,不同的抗体分子能与多种多样的抗原决定簇发生反应，具有多种多样的特异样，称为抗体的多样性。Ig合成的规律：首先，其多肽链不是由一个基因决定的。其次，存在有等位基因排斥现象。即在每一个B细胞中都有来自父系和母系各一条染色体，在相应部位上有编码H和L链的基因库，但在抗原作用下只能活化父系或母系的一个基因库。,（一）Ig的基因和基因重排,抗体基因：轻链、轻链和重链三个基因库。小鼠：分别位于第6、16、12号染色体；人体则分别位于第2、22、14号染色体。,（一）Ig的基因和基因重排,每个基因库中都有众多的分别控制Ig多肽链V区和C区的编码基因，而且控制V区的又有2种（L链）或3种（H链）基因，这些基因统称为种系基因。在B细胞分化成熟过程中，这些种系基因被随机选择和DNA重排，成为具有单一特异性的不同类或型的B细胞。,1、和基因库,人类基因库：含有至少100种V基因，编码氨基端起始部95个氨基酸，接下有5个J基因，编码V区其余的13个氨基酸（96108）。C基因只有一个，编码羧基端105个（109214）氨基酸。在B细胞分化成熟过程中，V/J基因连接，可组合至少500种以上V功能区。,轻链基因重排,轻链基因重排,1、和基因库,人类基因库：含有一套V基因。7个C基因中的每一个都伴有一个J基因。虽然有这些不同，但V-J重组的总体过程和基因相类似。,轻链基因重排,2、H基因库,VH基因约有100个，接下至少有20个D（多样性）基因和6个J基因。CH基因有9个，其顺序为C、C、C3、C1、C1、C2、C4、C、C2。,2、H基因库,在B细胞分化和成熟过程中，重排三次：D/J基因连接后再与V基因连接组合成V/D/J基因，可形成100206=12000种VH功能区。这样VH与VK功能区可组合成12000500=6106个抗原结合部位。,H基因重排,H基因重排,抗体类转换,在B细胞分化和成熟和过程中，可发生类转换即各种C基因分别与V/D/J基因重排成不同类和亚类的Ig。如：B细胞，先产生IgM，以后为IgA和IgD，最终为IgG或IgE等。,细胞因子在抗体类转换中的作用,IL-4是IgE唯一转换因子，可促进小鼠B细胞分泌IgG1，IFN-可促进小鼠B细胞产生IgG2，IL-5可促进IgA的产生。,分泌型与膜型Ig,(二)Ig的生物合成和抗体的产生,降解递呈抗原机体被APC捕获抗原多肽片段与MHC分子结合B细胞克隆B细胞活化、增殖分化为浆细胞产生Ig分子。其中浆细胞染色体上Ig基因基因发生重排能编码抗原特异性的抗体分子的基因转录连接mRNA核糖体多聚核糖体Ig合成功能单位粗面内质网上合移向糖基化成H链和L链装配成Ig分子滑面内质网高尔基体细胞膜分泌至细胞外游离的抗体镶嵌在B细胞膜上mIg识别抗原的受体。,六、单克隆抗体和基因工程抗体,（一）多克隆抗体：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonalantibody,PcAb）。,(二)单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),单克隆抗体是由B淋巴细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子上一种特定的抗原决定簇的纯抗体。,单克隆抗体是由一个B细胞克隆产生的,单克隆抗体的制备,将动物用抗原免疫，当动物产生良好抗体反应时，分离脾脏获得脾细胞悬液，加入骨髓瘤细胞进行细胞膜融合。将融合细胞混合液在“HAT”培养基上培养。骨髓瘤细胞将被HAT杀死，而脾细胞将在12周后自然死亡。最终只有融合细胞存活。,McAb的优点及作用,1、McAb特异性高，质地纯一，易标准化和大量制备；2、McAb可长期无限量供应完全同质的抗体；3、利用McAb研究细胞表面标志和受体；4