亲和层析PPT课件

.,1,亲和层析技术AffinityChromatography,.,2,亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法,什么是亲和层析?,.,3,基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如SepharoseHP，SepharoseFF,间隔臂:减少空间位阻效应，大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。,配基:和目标物有特异性相互作用的物质,耦连:将配基与基架以共价键的方式连接,.,4,配基与目标蛋白的特异性专一特异性配基：针对单一物质的特异性如：抗原抗体激素受体族特异性配基：针对一类结构或功能相似物质的特异性如：凝集素糖蛋白ProteinGIgG抗体Dye-stuffs（染料）酶,它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。,.,5,族特异性配基-1配基特异性ProteinAIgG的Fc片段ProteinGIgG的Fc片段ConcanavalinAGlucopyranosyl&Mannopyranosylgroups(伴刀豆球蛋白A)(吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团)CibacronBlue宽范围的酶，血清白蛋白,.,6,族特异性配基-2配基特异性精氨酸丝氨酸蛋白酶苯甲脒丝氨酸蛋白酶钙调蛋白钙调蛋白调控的蛋白肝素凝血因子,脂蛋白,脂酶,激素,类固醇受体,蛋白合成因子,核酸结合酶过渡金属离子含组氨酸的蛋白质和多肽,.,7,亲和层析的主要阶段,准备亲和层析的填料平衡上样和清洗洗脱目标物再平衡,.,8,洗脱条件的选择,亲和层析过程中的洗脱属于特异性的解离方式，洗脱剂的选择首先必须不会引起待分离物的变性失活。,样品上柱之后，用起始缓冲液把非专一吸附的蛋白质洗去，然后选择合适的条件将目的酶洗脱下来。如果酶和配基之间亲和力不高：通常是改变洗脱液的pH、离子强度等因子，用类似离子交换层析的方法将目的酶洗脱下来。如果目的酶与配基的亲和力很强：可向洗脱剂中加入与配基有更高亲和力的物质与目的酶竞争，而将目的酶洗脱下来。或使用极端的pH或其他蛋白质变性剂，如尿素和盐酸胍。但洗脱后应将洗脱峰迅速中和、稀释或透析，以保持酶的自然构象。,.,9,离子强度洗脱洗脱液离子强度增加有利于洗脱，可以用一步法或梯度变化，在高离子强度作用下使亲和力减弱，将被洗脱物洗脱下来。NaCl是常用的盐，一般在平衡液中加入0.5mol/L或者1mol/L的NaCl。改变pH值洗脱pH的变化可以改变结合位点上带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH值，载体、配基和被吸附物质的化学稳定性决定了pH使用的限度。,.,10,竞争性洗脱特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱，在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。,.,11,变性剂洗脱有的蛋白在一定浓度的变性剂中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、尿素等有利于蛋白质解离。,.,12,低pH下洗脱ProteinGSepharose分离IgG抗体结合缓冲液:20mM磷酸钠,pH7.0洗脱缓冲液:0.1M甘氨酸-HCl,pH2.7注意:为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于1MTris-HCl,pH7.5中,.,13,高盐洗脱在HeparinSepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白结合缓冲液:20mMTris-HCl,pH8,0.5MNaCl洗脱缓冲液:20mMTris-HCl,pH8,1-2MNaCl注意:为了维持活性常添加5%(v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂,.,14,用游离的配基类似物竞争洗脱用GlutathioneSepharose纯化GST标签蛋白结合缓冲液:PBS+1%TritonX-100洗脱缓冲液:10mM还原型谷光甘肽,50mMTris-HCl,pH8.0,.,15,用目标物质的类似物竞争洗脱用NiSepharose分离组氨酸标签蛋白结合缓冲液:20mMphosphate,0.5MNaCl,20-40mM咪唑洗脱缓冲液:结合缓冲液中加入500mM咪唑（终浓度）注意:若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入8M尿素或6M盐酸胍.,.,16,蛋白不挂NI柱的原因分析1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高2.PH太低（检查样品及缓冲液PH）3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）4.组氨酸标签在发酵