重金属Cu2+,Pb2+和Zn2+胁迫对近江牡蛎CrassostrearivularisSOD活性影响研究.doc

重金属Cu2+，Pb2+和Zn2+胁迫对近江牡蛎(Crassostrea rivularis) SOD活性影响研究江天久1, 3*，牛 涛21. 暨南大学理工学院环境系，广东 广州 510632；2. 暨南大学水生生物研究所，广东 广州 510632；3. 华南师范大学生命科学技术学院，广东 广州 510631摘要：为探讨将近江牡蛎（Crassostrea rivularis）抗氧化酶防御体系参数作为海洋重金属污染生物监测指标可行性，文章在实验室条件下，研究这三种重金属暴露对近江牡蛎（C. rivularis）鳃和消化腺组织SOD活性的诱导作用；实验结果表明：Cu2+, Pb2+和Zn2+能诱导近江牡蛎（C. rivularis）腮和消化腺SOD的产生，但由于近江牡蛎（C. rivularis）腮和消化腺的结构和功能的不同，在重金属的诱导下，消化腺内的SOD活性要比腮的大；Pb2+和Zn2+诱导近江牡蛎（C. rivularis）鳃和消化腺组织SOD活性变化的剂量效应均为抛物线型；Cu2+对近江牡蛎（C. rivularis）鳃组织SOD活性诱导曲线不呈抛物线型，而对消化腺组织SOD活性诱导的剂量效应呈抛物线型；根据对SOD活性影响的强弱，三种重金属对近江牡蛎（C. rivularis）的毒性强弱顺序为Cu2+Pb2+Zn2+。在实验室条件下，近江牡蛎（C. rivularis）消化腺组织中的SOD活性可作为养殖水体重金属污染程度监测指标，但应用到实际养殖水体尚须进一步研究。关键词：近江牡蛎；重金属；超氧化物歧化酶；中图分类号：X171.5 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2006）02-0289-06许多水生生物对重金属等污染物有很强的累积能力，可作为海洋污染的监测生物。但其体内污染物含量不能及时反映海洋污染的动态变化，也不能反映污染物对生物体生理生化的影响。水生动物生活在水体环境中，这个特殊环境的细微变化都将对它们的生理生化产生一系列的影响。有研究表明溶解氧、pH值、温度、重金属污染等，都会使其体内SOD活性发生显著变化1。所以对水生生物来说，SOD是一类敏感的分子生态毒理学指标2-3。国外已有一些科技工作者开展了旨在探讨以抗氧化酶作为水体污染监测指标的基础性工作，其结果表明以抗氧化防御系统参数作为海洋污染生物监测指标，尚存在许多问题，还需要在更多的有代表性的水生生物和常见的污染物之间做更多的基础研究4-7。贝类是我国近岸水产养殖的主要品种。2002年全国范围内调查显示海水贝类养殖产量占海水养殖总量的79.4，海水贝类养殖面积占海水养殖面积的66.98。在我国贝类养殖中，牡蛎尤其是近江牡蛎（Crassostrea rivularis）由于其对温度和盐度的广泛适应性，在我国南北沿海均有养殖，更是我国南方养殖的主要经济贝类，用其抗氧化酶防御体系参数作为水体重金属污染的生物监测指标在我国具有较广泛的代表性。本研究选取近江牡蛎鳃和消化腺组织为研究对象（其鳃是直接暴露于水体的组织，消化腺是其体内主要的解毒器官，重金属胁迫对这两种组织的生理状况影响较为显著）探讨用近江牡蛎抗氧化酶防御体系参数作为海洋重金属污染生物监测指标的可行性，为受到不同种类重金属污染的海区选择适宜的牡蛎品种提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料选择2龄近江牡蛎，体型、体重相差10%左右，实验前将近江牡蛎洗刷干净，清除附着物，置沙滤海水水泥池中暂养一周左右。暂养在自然光照和室温下进行，暂养期间不投喂饵料，昼夜连续充氧以保证水中溶氧充足。实验海水为无污染沙滤海水，其重金属质量浓度经测定符合一类海水标准（GB30971997）（实验期间水质由深圳市海洋与渔业环境监测站监测）。实验期间水温为1724 ，pH值为7.87.9，盐度为34左右。实验时，配制海水盐度为20，用去离子水稀释（使用之前用充氧机连续曝气48 h以上）。实验期间每天换水一次，同时添加重金属污染物，使各组水体中重金属浓度保持设定质量浓度（表1）。实验期间不投喂饵料，昼夜连续充气以保证水中溶氧充足。1.2 实验方法1.2.1 重金属对近江牡蛎SOD活性的影响Cu2+、Zn2+、Pb2+三种重金属离子按照海水养殖用水水质标准（NY5052-2001）和相关文献9分别设低、中、高三种质量浓度处理组（表1），并设一组空白对照组（共10组）。每组养近江牡蛎8只，每桶装海水40 L。暴露试验共进行6 d。实验结束后，去除牡蛎外壳，取其软组织，用蒸馏水冲洗其软体组织数次，用滤纸拭干后装入样品袋内于-70 保存至酶活性测定。表1 各组重金属污染物的设定质量浓度Table. 1 The concentration of heavy metals in seawater mgL-1组别1（低质量浓度组）2（中质量浓度组）3（高质量浓度组）Cu2+0.10.51.5Pb2+0.21.03.0Zn2+0.21.03.01.2.2 样品处理方法 将近江牡蛎样品置于冰箱冷藏室内解冻后，用滤纸拭干，分别取其鳃和消化腺组织，经组织匀浆机匀浆后，准确称取0.50 g放入玻璃匀浆器内，加三蒸水2 ml冰浴匀浆，匀浆液倒入离心管中，加3 ml三蒸水冲洗匀浆器，也倒入离心管中，在4 以4500 r/min转速离心30 min，取上清液，置于-20 冰箱中待测。上述样品处理到测定过程在48 h内完成。1.2.3 SOD活性测定方法（微量进样法）SOD的活性测定采用改进后的邻苯三酚（HO）3C6H3，1,2,3-benzenetriol）自氧化法，测定波长为=325 nm；酶活性单位定义为：每mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量10-11。用比活值来评价酶活性的大小。1.2.5 数据处理方法实验结果用统计软件SPSS10.0 for Windows进行处理，所得结果均以s表示；用回归方法分析污染物的剂量-效应关系，以相关系数表明相关关系是否显著。2 实验结果分析2.1 重金属对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响2.1.1 Cu2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响不同质量浓度的Cu2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响表明：Cu2+对近江牡蛎鳃组织SOD活性的诱导作用随牡蛎暴露在水体中的Cu2+质量浓度变化而变化，在0.11.5 mgL-1范围内，SOD活性表现为先升后降的变化规律。低质量浓度Cu2+（0.1 mgL-1）对近江牡蛎鳃组织SOD活性表现为一定的诱导作用，与对照组相比，SOD活性升高了16.2%；但随着Cu2+质量浓度的升高，SOD的活性呈逐渐下降趋势，中质量浓度处理组（0.5 mgL-1）鳃组织SOD活性为低质量浓度处理组的92.8%；当Cu2+质量浓度升高到1.5 mgL-1时，鳃组织SOD活性下降到仅为对照值的62.7%。不同质量浓度Cu2+对近江牡蛎消化腺组织SOD活性的诱导作用不同于鳃组织（图1），低质量浓度（0.1 mgL-1）和中质量浓度（0.5 mgL-1）Cu2+都对近江牡蛎消化腺组织SOD活性表现为诱导作用，与对照组相比，SOD活性分别上升了48.2%和114.0%；随着Cu2+质量浓度的升高，SOD的活性迅速下降到对照组水平以下，高质量浓度处理组（1.5 mgL-1）消化腺组织SOD活性仅为中质量浓度处理组的26.4%，为对照值的87.6%。用回归方法分析Cu2+的质量浓度与近江牡蛎消化腺组织SOD活性关系，结果表明：二者呈抛物线性相关，相关系数为0.984，相关性显著。图1 不同质量浓度Cu2对近江牡蛎组织SOD活性的影响Fig. 1 Effects on the activity of SOD in soft tissues of C.rivularis at the different concentration of Cu22.1.2 Pb2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响 不同质量浓度的Pb2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响实验结果表明：低质量浓度Pb2+（0.2 mgL-1）对近江牡蛎鳃组织SOD活性有一定的诱导作用，与对照组相比，SOD的酶活性升高了31.7%；随着Pb2+质量浓度的提高，SOD活性迅速上升，中质量浓度处理组（1.0 mgL-1）比对照组上升了60.4%；随着Pb2+质量浓度进一步提高，SOD活性迅速又迅速的下降到对照值以下，高质量浓度处理组（3.0 mgL-1）SOD活性为对照组的69.6%。用回归方法分析Pb2+质量浓度与近江牡蛎鳃组织SOD活性关系，结果表明：二者呈抛物线性相关，相关系数为0.974，相关性显著。图2 不同质量浓度Pb2对近江牡蛎组织SOD活性的影响Fig. 2 Effects on the activity of SOD in soft tissues of C.rivularis at the different concentration of Pb2图2也表明：低、中、高三种不同质量浓度Pb2+对近江牡蛎消化腺组织SOD活性的诱导作用变化规律与鳃组织相似。低质量浓度Pb2+（0.2 mgL-1）对近江牡蛎消化腺组织SOD活性有一定的诱导，与对照组相比，SOD活性升高了37.1%；中质量浓度处理组（1.0 mgL-1）对消化腺组织SOD活性表现为强诱导，比对照组SOD活性上升了近1倍，达到198.3%；随着Pb2+质量浓度进一步提高，SOD活性迅速下降到对照值水平以下，高质量浓度处理组（3.0 mgL-1）SOD活性是对照值的96.5%。用回归方法分析Pb2+质量浓度与近江牡蛎消化腺组织SOD活性关系表明，二者呈抛物线性相关，相关系数为0.992，相关性显著。2.1.3 Zn2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响不同质量浓度的Zn2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响如图3所示。实验结果表明，其影响规律与Pb2+处理组相似，但强度不同。虽然低、中质量浓度Zn2+均对近江牡蛎鳃组织SOD活性有一定的诱导作用，但低质量浓度（0.2 mgL-1）组的效果并不显著，与对照组相比，SOD的酶活性仅升高了3.6 %；中质量浓度处理组（1.0 mgL-1）对鳃组织SOD活性表现为较强诱导作用，但诱导作用比Pb2+的中质量浓度处理组要低，仅比对照组上升了35.2 %；随着Zn2+质量浓度进一步升高，SOD活性又迅速的下降，高质量浓度处理组（3.0 mgL-1）SOD活性比对照值升高19.5 %。用回归方法分析Zn2+质量浓度与近江牡蛎鳃组织SOD活性关系，结果表明，二者呈抛物线型相关，相关系数为0.972，相关性显著。图3表明，不同质量浓度的Zn2+对近江牡蛎消化腺组织SOD活性的影响规律与鳃组织相似。低质量浓度Zn2+（0.2 mgL-1）处理组近江牡蛎消化腺组织SOD活性比对照组升高了16.7 %；中质量浓度处理组（1 mgL-1）对消化腺组织SOD活性表现为较强诱导，比对照组SOD活性上升了73.2 %；随着Zn2+质量浓度进一步提高，SOD活性迅速也逐渐地下降，高质量浓度处理组（3.0 mgL-1）SOD活性比对照组升高32.5%。不同的Zn2+质量浓度与近江牡蛎消化腺组织SOD活性关系呈抛物线性相关，相关系数为0.998，相关性显著。 3 讨论3.1 重金属对近江牡蛎SOD活性的影响图3 不同质量浓度Zn2+对近江牡蛎组织SOD活性的影响Fig. 3 Effects on the activity of SOD in soft tissues of C.rivularis at the different concentration of Zn2+3.1.1 重金属对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响试验结果表明，Cu2+、Pb2+、Zn2+三种重金属离子对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响有如下规律：消化腺组织SOD的活性和敏感性要远远高于鳃组织；在实验期内，低质量浓度的重金属胁迫，诱导鳃和消化腺组织的SOD活性升高，高质量浓度的重金属胁迫，抑制鳃和消化腺组织的SOD活性。这个规律与鳃和消化腺的结构和功能有必然的关系。鳃是瓣鳃类动物主要的呼吸器官，由于鳃组织直接暴露于水体，而且其特殊结构有利于水中离子穿过，鳃成为近江牡蛎直接从水中摄取重金属的主要部位，所以当水体受到重金属污染后，必然会对鳃的生理状态产生一定的影响，腮中的SOD的活性也会受到影响。近江牡蛎的消化腺组织包被在胃的周围，包括肝脏、唾液腺及胰腺等组织12。肝脏是其体内主要的解毒器官，可分泌淀粉酶、蔗糖酶等多种酶，另外在其消化腺（肝脏）内有大量能做变形运动的（肝）巨噬细胞，它们有活跃的呑噬能力，毒物在肝脏内通过氧化、还原或水解过程转化成无毒、低毒易溶的代谢物排出体外，在该过程中会产生大量的超氧阴离子自由基；另外，当重金属污染胁迫时，重金属离子由鳃进入血液作用到很多的靶组织细胞，这些被伤害的组织细胞产生的代谢紊乱产物又汇集到肝脏。以上两个因素加在一起，使得重金属胁迫强烈地影响近江牡蛎消化腺组织SOD活性水平13-15。 综上可知，虽然鳃直接暴露于水体之中，但由于它的主要作用是作为呼吸器官，帮助近江牡蛎体进行气体交换，几乎没有解毒功能，因此SOD的活性和敏感性自然要比消化腺组织低得多，所以表现在重金属胁迫时，消化腺组织SOD的活性和敏感性要远远高于鳃组织。而且由于鳃组织没有解毒能力，因而较易受到水环境中有害物质的伤害，在实验中表现为Cu2+的中、高质量浓度处理组的SOD活性水平比低质量浓度处理组水平有明显的降低。3.1.2 不同质量浓度的重金属对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响国内外大量的研究表明，小剂量与大剂量的同一重金属元素对同一生理生态反应具有相反的效应，即小剂量的重金属离子对代谢有一定的“促进”作用16,17。Stebbing18认为毒物在低质量浓度下出现的这种现象，是其在无毒情况下的刺激反应，他把这一现象称为“毒物兴奋效应”；而大剂量的重金属离子则抑制正常的生理过程，我们在此称之为“毒物抑制效应”。在本实验中，牡蛎暴露于低浓度重金属组中，其鳃和消化腺组织SOD活性都要比对照组有明显升高，而暴露于高浓度重金属中，其鳃和消化腺组织SOD活性水平都显著降低，这表明在一定的时间内，在低浓度的重金属胁迫时，出现一定的“毒物兴奋效应”，这期间近江牡蛎体内产生过量的活性氧，诱导其体内SOD活性提高；但当重金属处理浓度过大，时间过长时，近江牡蛎体内产生大量的活性氧超过近江牡蛎体的SOD清除能力时，便产生“毒物抑制效应”，对组织和细胞造成损伤，影响近江牡蛎体的正常生理活动，使SOD活性降低和丧失，甚至导致细胞或者生物体死亡。 从实验结果来看，虽然鳃和消化腺都具有“毒物兴奋效应”，但消化腺组织“毒物兴奋效应”要比鳃组织表现高的多，甚至在这三种重金属的中浓度处理时，也表现出“毒物抑制效应”，这与其具有解毒功能有一定的关系。3.2 重金属Cu2+, Pb2+和Zn2+对近江牡蛎毒性大小 国内关于重金属对水生生物体的毒性研究已经有不少报道，不过，多数是关于重金属对鱼类和非双壳类海洋生物的毒性报道的19-22，专门研究重金属对双壳类的报道比较少。研究重金属在低浓度胁迫下单位浓度对近江蛎体组织SOD活性的诱导倍数，以此为指标评价这三种重金属对近江牡蛎的毒性大小（见表2）。表2数据表明，虽然不同的重金属在低质量浓度胁迫下，对近江牡蛎的鳃和消化腺SOD活性影响大小不同，但对二者的SOD的诱导能力都是Cu2+Pb2+Zn2+。水生动物体内SOD的活性变化程度间接反映了毒物对其影响的大小，因而这三种重金属对近江牡蛎体的毒性大小为：Cu2+Pb2+Zn2+，这个顺序与海水养殖水质标准（NY 5052-2001）中这三种重金属的最高限量值顺序相一致。虽然Cu是生物体必需的、具有一定生理功能的元素，但当其质量浓度超过生物体承受的阈值时，就会对生物体造成伤害。高浓度Cu2+对细胞膜结构具有毒性作用，Cu2+可使肝溶酶体膜磷脂发生氧化反应，导致溶酶体膜的破裂，水解酶大量释放，从而引起肝组织坏死23。已有的研究结果显示鱼对铜的耐受性较低20,21,24，这与我们的实验结果也较为一致，在中质量浓度Cu2+胁迫下，即对鳃组织造成一定的伤害，导致其SOD活性下降。所以，对近江牡蛎来说，Cu2+也是剧毒物质，对其耐受性不高。表2 低浓度胁迫下单位浓度重金属对近江蛎体组织SOD活性的诱导倍数Tab. 2 The induction multiples of the activity of SOD in soft tissues of C.rivularis under the press of unit concentration of metals项目Pb2+Zn2+Cu2+质量浓度/(mgL-1)0.20.20.1鳃组织6.595.1811.6消化腺组织6.865.8314.8Pb2+在低质量浓度（0.2 mgL-1）和中质量浓度（1.0 mgL-1）处理下，SOD活性逐渐上升，而且随质量浓度增加活性相应增加，表明产生的氧自由基可完全被歧化，Pb2+对近江牡蛎鳃和消化腺组织SOD活性的影响相对较小，但当Pb2+的处理质量浓度为3.0 mgL-1时，鳃和消化腺中的SOD活性明显的下降。说明近江牡蛎对Pb2+有一定的耐受性。实验结果表明Zn2+对近江牡蛎也是低毒物质，这与Zn2+对金鱼也是低毒的观点是一致的25。近江牡蛎对Zn2+的耐受性较高，中质量浓度(1.0 mgL-1)下对其鳃和消化腺组织都没有造成明显伤害。Zn是动物和人体的必需微量元素，在生物体中，Zn既是许多酶的组成部分，又可以影响某些非酶的有机分子配位基的结构构型。总体来看，这个试验结果与汤鸿等13研究结果较为一致，他认为重金属对锯缘青蟹仔蟹（Scylla serrata）毒性大小为Cd2+Cu2+Zn2+；也与杨丽华等人的研究结果一致21，她研究重金属对丰产鲫(Carassius auratus of Penze()Cyprinus acutidorsalis ()的急性毒性实验，认为重金属毒性大小顺序依次为Cu2+Zn2+Cr6+；但与王银秋等22研究重金属对鲫鱼（Carassius auratus）和泥鳅（Misguruns anguillicaudatus）的相对毒性的结果(Zn2+Pb2+)不一致。这可能与同样的重金属对不同的动物的毒性不同，即使对同一动物来说，在其不同的生长阶段的毒性也不同的原因造成的。为方便研究，本实验仅考虑单一重金属对牡蛎的毒性，事实上，各种重金属离子共存时可能存在某种协同或拮抗作用，实验进行的预处理也能缓解重金属毒性，此外，盐度、温度、溶氧等理化因子的改变对重金属的毒性也可能产生影响，如pH值也能影响LC50值26。因此在考察水体中重金属单因子对水生生物毒性大小时，应考虑水体中混合毒物毒性的变化和相互影响。3.3 近江牡蛎SOD活性作为养殖水体重金属污染指标的探讨 前面的讨论中已经说明不同质量浓度的重金属胁迫会导致近江牡蛎体内活性氧自由基水平不同。在一定的时间内，如果产生的活性氧自由基的水平一直在近江牡蛎体能够处理的“阈值”范围之内的话，活性氧自由基诱导生物体内SOD活性也会相应提高，所以表现出来的SOD活性与重金属胁迫的质量浓度呈一定的“剂量效应”关系。对于近江牡蛎来说，由于其消化腺有一定的解毒作用，它对养殖水体中的重金属污染的水平有较强的敏感性，在一定浓度范围内，随着质量浓度的增大和时间的延长，其活性也逐渐增大，呈现明显的“剂量-效应”关系。在低质量浓度微污染水体中，重金属质量浓度和SOD活性表现为线性关系，故消化腺组织中的SOD可作为检测重金属对近江牡蛎毒性影响的生化指标。 对于鳃组织来说，因为它不具解毒能力，对水体中的重金属毒害自身的调节能力较差，敏感性不及消化腺组织强，所以，尽管它在一定的范围内也和养殖水体中的重金属浓度水平呈“剂量-效应”关系，但其并不适宜用来作为养殖水体中重金属污染监测指标。必须同时指出的是，海洋污染的成分是非常复杂的，不但存在重金属污染，还有石油污染、有机物污染等，对重金属污染来说，成分也不只是一种，这样就更增加了用近江牡蛎组织SOD作为养殖水体重金属污染指标的复杂性。所以，用近江牡蛎组织SOD活性作为养殖水体重金属污染程度监测指标尚须进一步研究。参考文献：1 李光友. 中国对虾疾病与免疫机制J. 海洋科学, 1995(4):1-3.LI G Y. 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