不同产地首乌药材HPLC指纹图谱的研究.doc

不同产地首乌药材HPLC指纹图谱的研究作者：刘旭单位：山东青岛，解放军第401医院药剂科【摘要】 目的 建立首乌药材的HPLC指纹图谱，考察不同产地首乌的药材质量。方法 采用高效液相色谱法，建立首乌药材的指纹图谱，流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测波长为254nm。结果 建立的指纹图谱共确定了7个共有峰，结果稳定，重复性好。结论 用该方法建立首乌药材的指纹图谱，对首乌药材的质量控制是可行的。 【关键词】 首乌 指纹图谱 高效液相色谱法 Study on fingerprint of radix polygoni multiflori from different habitats by high-performance liquid chromatography LIU Xu, FU Qing-jie, YANG Xue-mei,et al.Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingdao 266071,China 【Abstract】 Objective To investigate the quality of Radix Polygoni Multiflori from different growing areas.Methods HPLC method was used to establish the fingerprint of Radix Polygoni Multiflori, with a mixture of CH3CN-H2O as the mobile phase, with a wavelength at 254nm. Results The HPLC fingerprints of Radix Polygoni Multiflori has been established. The result is stable. Conclusion The fingerprint can be used for quality control of Radix Polygoni Multiflori 【Key words】 radix polygoni multiflori;fingerprint; HPLC 何首乌（Radix Polygoni Multiflori）是蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum）的干燥块根，主产河南、广东、贵州、湖北、江西等地。何首乌的主要有效成分是蒽醌类、羟芪衍生物（以二苯乙烯苷含量最高）及磷脂类等。临床上分生首乌和制首乌两种饮片，生首乌苦、甘、涩、温，归肝、心、肾经，有解毒、消痈、润肠通便等功效。生首乌经炮制成制首乌后，平性转温、苦味转甘，补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨1。本实验旨在研究何首乌药材的指纹图谱，同时也对不同产地首乌药材的质量做了考察。 1 仪器和试药 美国Agilent1100高效液相色谱仪；电子分析天平（上海第二天平仪器厂MA110型）。二苯乙烯苷标准品（批号:0844-200003）购自中国药品生物制品检定所；首乌药材由解放军第二军医大学生药教研室鉴定；乙腈、甲醇（色谱纯，Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany）。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Hypersil （250mm4.6mm，5m）C18柱；流动相：乙腈水10：90（15min）20：80（35min）30：70（45min）80：20 v/v）；流速：1ml/min；柱温：30；检测波长：254nm。 2.2 检测波长的选择 本实验采用二极管阵列检测器，在分析时进行全波长紫外扫描，并在不同波长下获取数据，经比较后表明254nm色谱图峰形最好，出峰数目适中，各色谱峰相互之间分离度较好，故检测波长定为254nm。 2.3 HPLC供试品溶液的制备 精密称取首乌药材粗粉（40目）1g，75%甲醇10ml超声提取20min（2次），滤过，合并浓缩滤液，用甲醇定容至10ml，过0.45m微孔滤膜，即得；另精密称取对照品1mg左右，置25ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得对照品溶液（避光保存）；上述样品备HPLC分析使用。 2.4 测定指纹图谱的方法考察 精密吸取供试品溶液20l，注入HPLC仪，按2.1项下色谱条件测试，记录60min色谱图。 2.4.1 精密度实验 精密吸取首乌供试品溶液，连续进样5次，测定HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.61%，相对保留时间的RSD均小于0.75%，仪器精密度良好。 2.4.2 稳定性实验 精密吸取同一批药材制备的供试品溶液，分别在放置0，2，4，8，12，24h后测定指纹图谱， 结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于2.02%，相对保留时间的RSD均小于0.93%，表明样品在24h内稳定性良好。 2.4.3 重现性实验 平行操作制备5份首乌供试品溶液，测定HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于2.68%，相对保留时间的RSD均小于1.26%，方法重现性良好。 2.5 指纹图谱的测定及技术参数 2.5.1 指纹图谱的测定 取6批不同产地来源的首乌供试样品，按2.1项下条件进行HPLC分析，实现了峰与峰之间的良好分离，确定了7个共有峰（见图1）。 图1 首乌药材的指纹图谱 Fig 1 HPLC fingerprint of Radix Polygoni Multiflori 2.5.2 参照物的选择 在HPLC图谱中选择峰面积较大、出峰时间适中且稳定的色谱峰作为参照峰2，结果14.7 min的色谱峰符合此条件，经对照品对照确定为二苯乙烯苷的吸收峰，且二苯乙烯苷为首乌的主要活性成分之一，故选择二苯乙烯苷作为参照物（s）。 2.5.3 共有峰的相对保留时间 相对峰面积指纹图谱相似度计算选取色谱图中的7强峰，由色谱工作站辅助自动进行峰匹配，确定7个共有峰。以二苯乙烯苷色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内，结果见表1和表2。 表1 首乌药材的HPLC指纹图谱中共有峰的相对保留时间表2 首乌药材的HPLC指纹图谱中共有峰的相对峰面积 3 讨论 中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础，也是质量评价的难点与重点。目前，大量中药在其有效成分尚未被阐明的情况下，只采用单一或少数几个成分做指标进行质量评价，往往不能全面反映其质量情况。目前能较客观反映复杂体系中化学成分全貌的指纹图谱，是唯一获得国际认可的中药质量控制技术，正得到普遍重视3。在原药材GAP生产基础上，建立中药材、中成药指纹图谱的全面质量控制，必将成为中药质量评价的发展趋势，在中药质量控制领域有广阔的应用前景4。本实验建立了首乌药材HPLC指纹图谱，确定了7个共有峰，其相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内，在此基础上确认了各共有峰的归属；计算了指纹图谱的相似度，结果均在0.99以上，上述结果表明所建立的指纹图谱的技术指标稳定，重现性好。本实验结果能使首乌药材中尚不明确的众多成分由无序到有序，使各成分的来源明晰，并依其相对保留时间和相对峰面积等参数来客观地评价了药材的内在质量。【参考文献】 1 鲁静，粟晓黎高效液相色谱法测定何首乌及制首乌中羟芪衍生物的含量药物分析杂志，2000，20（2）：104.2 Rao C, Zhou BH, Lei JC, et alFinger print technique of the traditional Chinese medicine and its applicationHerald of Medicine ,2005,24 （3）:218.3 Huang S, Gu L, Huang HZ, et alStudies on finger print of the tradit