【毕业学位论文】（Word原稿）抗虫棉田残留Bt杀虫蛋白检测及对土壤微生物的影响农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 抗虫棉田残留 虫蛋白检测 及对土壤微生物的影响 of t in of on he of t in of on 要 检测抗虫棉田土壤中残留的 虫蛋白 的降解动态，明确其对土壤微生物的影响是转基因棉花环境安全研究的重要内容。本文综合运用生物化学、生态学、土壤微生物学等学科的理论与方法，以转 因棉、转双价基因（ 和常规棉品种为试验材料，对抗虫棉棉叶中虫蛋白在土壤中的降解动态、根系中分泌 虫蛋白的规律、土壤中残留的 虫蛋白的检测技术及降解规律、不同生育期土壤微生物的数量等开展了研究。本研究旨在为转基因棉花安全性评价积累科学数据，对于保护生态环境和人类健康，保障生物技术的健康发展具有重要的意义。主要研究结果如下： 1、 采用 法检测了转 因棉（ 转双价基因（ （中棉所 41）叶片中 虫蛋白在土壤掩埋条件下的降解动态。明确了转 因棉和转双价基因棉叶片中虫蛋白的降解 动态 基本一致， 降解周期达六个月； 叶片掩埋后第 1 3 个月，杀虫蛋白 降解最为 迅速 ， 第 4 6 个月 降解缓慢， 第 7 个月棉叶中已 检测不到 虫蛋白。 2、 测定了 转 因棉（ 转双价基因（ （中棉所 41） 不同 生育期 根系 中 虫蛋白 含量 的变化动态 。 明确了 转 因棉和转双价基因棉根系中 虫蛋白的 含量 变化趋势 基本一致， 5 月份 杀虫蛋白含量 最高，分别为 ng/g 和 ng/g， 6 月份开始迅速下降， 9 月份含量分别 下降到 ng/g 和 ng/g； 10 月份至次年 3 月份， 棉株 根系中 t 杀虫蛋白 含量逐渐下降，至次年 4 月份 已检测不到 虫蛋白。 3、 建立了 抗虫棉 田 土壤 颗粒 中 虫蛋白的 检测方法。 确定了 土壤中 虫蛋白 提取的最佳时间为 20 h， 提取原液的浓度为 g提取原液的最佳稀释倍数为 2 倍 ， 明确了抗虫棉田土壤的 取样 部位是距离棉株主茎约 010 距 离地表深度约 1020 位置。 4、 检测了 转 因棉（ 转双价基因（ （中棉所 41） 田土壤中 虫蛋白的降解动态 。 明确了 转 因棉和转 因棉 田土壤中 虫蛋白的降解 动态基本一致 ； 两类抗虫棉 播种前 土壤中 均检测不到 虫蛋白 ，苗期开始 虫蛋白的含量逐渐增加，至花期均达到最高峰（ ng/g 和 ng/g） ， 铃期以后逐渐下降，至 收获期 分别下降到 ng/g 和 ng/g；棉花收获后 六个月内 ，两类抗虫棉田土壤中 虫 蛋白 含量迅速降低 ， 直到次年 4 月份已检测不到 虫蛋白。 5、 明确了 种植 抗虫棉不同 年限土壤中 虫蛋白含量除 9 月和 11 月份差异达显著水平外，其他月份的差异均不显著 。 表明抗虫棉种植年限总体而言对土壤中 虫蛋白含量的 变化 无明显的影响。不同种植年限的抗虫棉棉田杀虫蛋白含量的降解规律基本一致。 6、 运用平板计数法测定了 转 因棉（ 棉所 30、邯 5158） 、 转双价基因（ （中棉所 41、 棉所 1904） 和常规棉（中 23） 土壤中微生物 的种群数量，明确了两类抗虫棉田真菌和放线 菌的数量在不同生育期均明显高于常规棉， 各类棉田 细菌的数量品种间差异较大。 关键词 ： 转基因 抗虫 棉 ， 土壤 残留 ， 虫蛋白 ， 微生物 he to of t on of in t of we of t in t in of t by of to an of of as 1. t of t 1) in We t of t 1) in to t t be in th 2. t in of t 1) in t in t ng/g g g g of t t be at 3. of t in in t We of t 0th of of t as 10020 4. t in of t 1) t Bt be t t in ( g g), g g to t in in t be of 5. We t in in It t in of t in t in in 6. in in t 0, 158), 1, 904) 23) by We of in in of in ey Bt 录 第一章 绪 论 . 1 内外转基因植物研究现状及趋势 . 1 外转基因植物的研究现状与趋势 . 1 国转基因植物的研究现状与趋势 . 2 t 基因及 因的设计和合成 . 3 因和转 因抗虫棉的商业种植 . 4 基因植物环境安全性研究现状 . 5 因漂流 . 6 非靶标生物的影响 . 7 天敌的影响 . 7 基因植物对土壤生态系统的影响 . 11 基因植物释放的 虫蛋白进入土壤的途径 . 11 物活性杀虫晶体蛋白在土壤中的行为及存活特性 . 12 虫棉棉花根 系分泌物中 虫蛋白的残留特性 . 12 基因抗虫植物对土壤微生物的影响 . 13 壤中 虫蛋白的测定方法 . 14 V 究目的和意义 . 15 究目的 . 15 究意义 . 15 第二章 不同类型转基因抗虫棉叶片中 虫蛋白在土壤中的降解动态 . 17 料与方法 . 17 验材料 . 17 验方法 . 17 定不同类型转基因抗虫棉叶片 虫蛋白的含量 . 17 果与分析 . 18 基因抗虫棉 片中 虫蛋白含量的变化 . 18 基因抗虫棉中棉所 41 叶片中 虫蛋白含量的变化 . 20 同品种转基因抗虫棉叶片中 虫蛋白含量变化 . 21 花叶片中的 虫蛋白在土壤中的降解规律 . 21 结与讨论 . 23 第三章 抗虫棉根系中 虫蛋白含量及动态变化规律 . 25 料与方法 . 25 验材料 . 25 验方法 . 25 育期间抗虫棉在根系中 虫蛋白含量测定 . 25 果与分析 . 25 结与讨论 . 27 第四章 土壤 中残留 虫蛋白检测方法研究 . 28 料与方法 . 28 验材料 . 28 验方法 . 28 虫棉土壤中 虫蛋白测定 . 29 果与分析 . 29 虫棉土壤中 虫蛋白提取时间的确定 . 29 虫棉土壤中 虫蛋白提取原液浓度及其稀释倍数确定 . 32 花土壤样品采集部位的确定 . 34 结与 讨论 . 37 第五章 不同抗虫棉品种土壤残留 虫蛋白的含量及降解动态 . 39 料与方法 . 39 验材料 . 39 验方法 . 39 虫棉土壤中 虫蛋白测定 . 40 果与分析 . 40 同抗虫棉品种土壤残留 虫蛋白随时间的含量变化 . 40 同抗虫棉品种土壤中 虫蛋白的降解动态 . 40 结与讨论 . 42 第六章 不同种植年限的抗虫棉田残留 虫蛋白含量及降解动态 . 43 料与方法 . 43 试验材料 . 43 验方法 . 43 同种植年限的抗虫棉田土壤中 虫蛋白测定 . 43 果与分析 . 43 同种植年限的抗虫棉田土壤中 虫蛋白的含量变化 . 43 同种植年限的抗虫棉田土壤中 虫蛋白的降解动态 . 44 结与讨论 . 46 第七章 抗虫棉土壤中 虫蛋白对土壤微生物的影响 . 47 料与方法 . 47 验 材料 . 47 验方法 . 47 壤微生物的分离与计数 . 48 壤微生物的统计分析 . 48 果与分析 . 48 虫棉对土壤细菌的影响 . 48 虫棉对土壤真菌的影响 . 49 虫棉对土壤放线菌的影响 . 50 结与讨论 . 51 第八章 结论和讨论 . 52 论 . 52 论 . 53 虫棉叶片在土壤中 虫蛋白的降解动态 . 53 虫棉根系中 虫蛋白的含量变化及其降解规律 . 54 虫棉土壤中 虫蛋白的测定方法 . 55 虫棉土壤中 虫蛋白随时间变化的降解动态 . 56 虫棉对土壤微生物的影响 . 56 参考文献 . 58 致 谢 . 66 作者简历 . 67 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 云金芽抱杆菌 豆胰蛋白酶抑制基因 虫晶体蛋白 硫苏糖醇 抗坏血 酸 苯二胺 氧核糖核苷酸 联接免疫吸附剂测定 际农业生物技术应用服务研究所 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 内外 转基因植物研究 现状 及趋势 二十世纪七十年 代初期，美国斯坦福大学的 授和加州大学 授合作，将不同来源的基因切割、拼接成一个杂合 子，首创了重组 技术。几年后，重组 术与其它学科相结合，发展成为一种崭新的现代生物技术 基因工程技术。基因工程技术与传统生物技术之间的最显著区别是它可以打破自然界的物种界限，将不同物种的基因按照人们的意愿重新组合，从而创造自然界本来不存在的、具有新性状的生物。 1981年， 首次成功地克隆了第一个编码 虫晶体蛋白的基因，揭开了利用 基因工程培育抗虫植物的序幕。 转 因植物的问世，无可置疑给害虫防治工作带来了一条崭新的途径。到 20 世纪 90 年代中后期， 物已在世界范围内商业化种植。我国 1997 年开始 花的商业化生产， 2006年达到 350 万公顷，占棉花种植面积的 66 （ 006） 。 外 转基因植物的 研究 现状 与趋势 利用转基因技术提高粮食产量是世界各国优先研究的课题之一。自 1983 年美国科学家首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，转基因植物的研究和发展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达 35 个科 120 种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等粮食植物；棉、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济植物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜植物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉以及杨树等树种。所涉及到的转基因性状包括抗虫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗除草剂、抗旱、抗盐渍，以及品质改良、生长发育的调控和提高产量等。在已经或者即将进行商业化生产的转基因生物中，转基因植物所占的比重最大，而转基因动物和转基因微生物则少的多。在转基因植物的研究 开发和商业化生产方面， 员国中的美国、加拿大、日本、澳大利亚等处于世界先进水平。 转基因植物工程在减少病虫害方面也取得了突破性进展。据估计，目前世界上每年因病虫害和杂草而损失大约 1/3 的农 作 物，造成的经济损失高达数千亿美元。重组 术的发展，可将动物、植物、微生物的基因相互转移，打破了物种之间难以杂交的天然屏障。迄今为止，已经把具有实用价值的目的基因，如抗病毒、抗虫、抗除草剂、改变花色和花形、延长保鲜期等基因分别转入到了烟草、马铃薯、棉、番茄、大豆、苜蓿、矮牵牛等植物中，取得了可喜的成就。转基因 植物工程对未来农业将会产生不可估量的影响。 国际农业生物技术应用服务研究所 （ 于 2006 年发布的资料显示，至 2005 年在全球 21 个国家转基因植物推广应用总面积达到 9000 万公顷， 1996 年至 2005 年十年间全球转基因作物种植面积增长近 53 倍，累计种植面积已达 公顷 （ 合 亩 ） ，相当于我国耕地面积的 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 国转基因植 物 的 研究现状 与趋势 我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，棉花是国民经济的重要战略物资。 1992 年，由于棉铃虫的危害，北方棉区减产皮棉 8 万吨，直接经济损失达 50 亿元，间接经济损失达 100 亿元。为了从根本上解决棉花生产的棉铃虫危害问题， 199