【毕业学位论文】（Word原稿）小麦组织培养再生系统的优化及DREB1A基因的转化作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦组织培养再生系统的优化及 因的转化 I 要 小麦基因枪法遗传转化中幼胚组织培养很强的基因型依赖性问题，在很大程度上限制了转基因小麦的广泛应用，因此，探索建立旨在克服基因型障碍的小 麦高效再生系统对于促进转基因小麦规模化应用具有重要意义。 本试验选用 3 个冬小麦材料 究了不同取材时期、不同诱导培养基、不同分化培养基和不同生根培养基对小麦幼穗离体培养的影响。结果表明，在护颖原基形成期至雌雄蕊原基形成期之间对小麦幼穗进行离体培养都可获得较高的绿苗分化率，并确定了小麦幼穗离体培养的最佳诱导培养基为 ， 4，最佳分化培养基为 养基，最佳生根培养基为 1/2 0g/L 蔗糖，在此基础上建立了小麦幼穗离体培养的高效 再生系统。 利用建立的小麦幼穗离体培养再生系统，连续两年对 17 个基因型幼穗和幼胚外植体的愈伤组织诱导率和绿苗分化率的比较研究显示，各基因型愈伤组织诱导率在两种外植体之间虽无显著差异，但 17 个基因型中有 15 个基因型幼穗外植体的绿苗分化率高于其相应幼胚外植体的绿苗分化率，表明幼穗是很好的外植体材料。 了验证本研究建立的适期幼穗再生系统应用于基因枪转化的效果，本试验选取幼胚再生频率较低（低于 20%）的 个基因型材料，以其适期幼穗和幼胚为受体进行了因的转化， 个基因型幼穗受体的转化效率分别达到 而其相应幼胚受体均未能获得转基因植株。 对 转 系萌发期和苗期的耐旱性鉴定结果表明，萌发期和苗期的抗旱鉴定结果并不完全一致，但 个转基因株系萌发期及苗期的各项测定指标均好于对照，初步说明这三个转基因株系具有较好的耐旱性。 关键词 ：小麦幼穗，小麦幼胚，植株再生，基因枪转化， on of to a of of to in of to a 6756, to of on of of of S+2,4,S, + 0g/L An of By of 7 of in to no in of of of 5 of 7 a in in 6756 311, of 0%. As a of 311 6756 to no in 311 6756 as 3 6756 of at 6756at 6756 of of 录 摘 要 . I . 一章 绪论 . 献综述 . 麦组织培养国内外研究进展 . 麦转基因国内外研究进展 . 于 录因子 . 究目的和意义 . 验内容和方法 . 第二章 小麦幼穗高效再生系统的建立 . 17 言 . 17 料和方法 . 17 料 . 17 法 . 17 2 3 结果与分析 . 19 麦不同发育时期幼穗的愈伤诱导和分化 . 19 同诱导培养基对小麦幼穗愈伤组织形成和分化的影响 . 22 同激素配比对愈伤组织分化的影响 . 24 同生根培养基对再生苗的影响 . 25 麦幼穗离体培养再生系统的建立 . 26 麦幼穗、幼胚外植体组织培养比较研究 . 26 2 4 小结 . 28 V 第三章 抗逆转录因子 因转化小麦 . 31 言 . 31 料和方法 . 31 料 . 31 法 . 32 果和分析 . 35 麦幼穗、幼胚转化体的筛选与植株再生 . 35 0代抗性株的分子检测 . 37 3代转基因植株的耐旱性鉴定 . 39 结 . 42 第四章 讨论与结论 . 43 论 . 43 麦组织培养中的基因型依赖性问题 . 43 麦基因枪转化中受体系统的选择 . 43 因与小麦的耐旱性 . 44 一步研究的工作 . 44 论 . 45 参考文献 . 46 附 录 . 54 致 谢 . 56 作者简历 . 57 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪论 献综述 麦组织培养国内外研究进展 20 世纪初，在 胞学说的推动下，德国植物生理学家 出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，即植物细胞具有全能性。 1934年， 体培养番茄根尖获得成功，由此开始了植物组织培养研究。植物组织培养象其他科学领域一样，开始时也只是一种纯学术的研究，用以回答有关植物生长和发育的某些理论问题。但其发展的结果，却显示出巨大的应用价值。植物组织培养一方面可为遗传工程提供理想的受体材料，另一方面又可为常规的植物改良提供一种新的手段，从而使很 多用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快更好地创造出各种农作物和园艺植物的新品种、新类型和新种质（李浚明，1992）。 在几种主要禾本科农作物中，小麦体细胞组织培养的成功比玉米和水稻略晚。 20世纪 50些研究者以小麦根为外植体进行离体培养，但未能获得愈伤组织（ 1951；1957； 1963）。直到 1968年 et 乎各种器官、组织都曾被用作外植体进行离体培养。其中，小麦 根（ et 1969； 1977；蔡润等 1999和 2000）、幼叶（ et 1982； 983； 王万军等， 1998）、中胚轴（ et 1982）、顶端分生组织（ 1983）由于培养效率普遍较低，致使很难应用。相比之下，小麦原生质体、花药、幼穗、胚（幼胚及成熟胚）培养应用广泛， 迄今，人们采用小麦幼胚、幼穗、成熟胚、悬浮系以及原生质体进行离体培养均已获得再生植株 ，且 发现幼胚和幼穗愈伤组织具 有较好的再分化能力（ 1982； 983； 1993； 1995）。 麦原生质体培养 与玉米、水稻相比，小麦的原生质体培养成功的较晚， 自 次获得小麦原生质体再生植株以来，现已分别从小麦花粉、成熟胚、幼穗、幼胚起源的愈伤组织悬浮细胞分离的原生质体培养得到了再生植株（王海波等， 1989；郭光沁等， 1990； et 1990；李宏潮等， 1991； He et 1992；侯丙凯等， 1996），但总体进展缓慢。 这主要是由于 小麦原生质体离体培养基因型依赖性强，培养的周期长、效率低、重复性差且技术要求较高； 在 小麦原生质体长期培养过程中，再生植株还会出现较高频率的白化苗和育性下降等现象 ，从而限制了原生质体技术在小麦遗传育种中的应用（朱根发等， 1995；余舜武中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 等， 2001）。如何突破基因型的限制，稳定地获得适于原生质体培养的胚性细胞系，仍是有待解决的问题。 麦花药培养 20 世纪 70 年代初，国内外几个实验室首次通过花药培养诱导小麦花粉植株成功（欧阳俊 闻等， 1973；朱至清等， 1973； et 1973），之后许多研究者对小麦花药培养条件和培养方法等进行了深入细致的研究（欧阳俊闻等， 1973； et 1975；胡道芬等， 1986；胡含， 1988；et 1998）。经过 30 多年的探索，小麦花药培养的研究取得了显著进展，特别是通过培养技术和培养基组分的不断改进，大大提高了绿苗分化率，完善了花药培养技术。 目前已获得不少优良培养基配方，其中 养基（朱自清等， 1974）、 养基（王培等， 1986）和 阳俊闻等， 1989）等在小麦花药培养中得到广泛应用。另外廖祥儒（ 2000）报道，接种前对花药进行低温预处理和接种后短时间的高温培养能明显地提高花粉植株的诱导率，愈伤组织分化前的低温处理及分化过程中的变温处理对大多数基因型具有促进绿苗分化的作用。李景琦等（ 2002）研究表明，在诱导培养基中添加 明显缩短出愈时间 3高花药愈伤组织诱导率。 在小麦花药培养中，核基因的作用明显，且花药培养中愈伤组织诱导率，总植株再生率及绿色植株再生率属多基因控制的彼此独立的数量遗传性状。对于花药培养反 应的细胞质效应，不同研究者 因试材的差异而结果不同 (田增荣， 1992)。 一些研究 (1982； 1985； 1989)表明，小麦品种内互交母本效应 很弱或不存在，而 1984)则 发现有明显的细胞质效应。 一些研究者还利用非整倍体、代换系和附加系对与花药培养反应紧密相关的染色体进行了研究。 1975年日本的 染色体组 (双端体、缺体和单体 )的 11个 非整倍体系花药培养研究指出， 4开大学张玉玲等 (1983)利用中国春 21个单体系研究了花粉愈伤组织产量的遗传控制，认为 21985)在用具有 位系的小麦杂交实验中发现 1987)对 7个中国春黑麦附加系进行的花药培养分析结果表明， 41989)以中国春单体系，代换系和易位系等为材料研究指出， 55 由于小麦花药培养可以快速 获得大量单倍体，通过加倍而获得稳定 的纯和二倍体，可缩短育种年限，提高育种效率， 因此，花药培养已作为一种育种手段被广大育种工作者广泛应用。目前已应用花药培养技术选育出了一批小麦新品种， 不少品种在生产上大面积种植， 其中较著名的有我国的京花 1 号（胡道芬等， 1986）和法国的 是，由于小麦花药培养基因型间的培养力差异非常显著 (胡道芬， 1991)， 在育种实践中仍有许多配组出苗率极低或根本不出苗 ,很多基因型的白化苗频率较高，加倍效率较低，小麦花药培养效率有待进一步提高。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 麦胚培养 据所 用胚的发育状态，胚培养分为幼胚培养和成熟胚培养。幼胚培养是指子叶期以前具胚结构的幼小胚离体培养。成熟胚培养一般指对子叶期后至发育完全的胚的离体培养。 麦幼胚培养 小麦幼胚培养始于 1978年， 20多年来，人们对于幼胚培养技术的研究不断深入。大量研究表明，幼胚外植体具有取材方便、操作简单、污染率低、诱导分化率高、体细胞变异范围大以及便于诱变处理等优点，被认为是小麦离体培养最有效、最理想的外植体来源（ 979； 982； et 1984；梁竹青等， 1988； et 1995）。 一些研究者对基因型、取材时期、培养基和接种方式等对小麦幼胚培养植株再生的影响进行了研究，并指出基因型、取材时期和培养基是影响小麦幼胚离体培养植株再生的 3个主要因素(1990； 1990)，且基因型之间的差异可能更大 (1986)。安海龙等（ 2000）研究表明， 小麦 基因型和培养基之间存在着一种互作关系，一些 基因型在某种培养基上反应良 好而在另一种培养基上生长不佳，而另外一些基因型则表现恰恰相反； 不同基因型和幼胚取材时期之间的差异要大于不同培养基之间的差异，同时很难区分清楚基因型和幼胚取材时期两者究 竟是谁对小麦幼胚培养再生植株的影响更大。 小麦幼胚的培养再生过程往往表现出明显的基因型差异，不同的小麦基因型可以在致密愈伤组织的诱导、分化以及分化能力的保持等方面表现出较大的差异 (1982； 1983；梁竹青等， 1986；曾寒冰等， 1988；刘少翔等， 2003)。而另外一些研究表明（于晓红， 1999） ,各基因型的诱导 率无显著差异，但愈伤组织的绿斑率及短期培养后的植株再生率间均有很大的差异， 基因型影响愈伤组织的分化率。王睿辉 (2002)研究认为 ,基因型对胚性愈伤组织诱导率的影响显著而对出愈率影响不大。 选择适当发育程度的幼胚作外植体是关系到培养成败和效率高低的关键因素。由于各地、各年的气候条件不同，品种间幼胚的发育速度也不一致，因此多数学者认为用胚的大小来做为取材标准可能比胚龄更为可靠。迄今多数作者 (1979； 1982；梁竹青等， 1986；蔡体树等， 1989)报道的幼胚接种最适大小都在 2以 相当于授粉后 14天左右 )更为普遍。 1983)认为，小麦盾片长度在 片长度在 体树等 (1989)用 7个品种进行了实验，结果表明 1于 更多的会在培养基上萌发，小至 00的频率形成愈伤组织和幼苗，这与 1982）认为小于 1是胚越小， 形成愈伤组织和愈伤组织发生分化所需的时间越长，而且蔡体树认为最适胚龄也决不只有一天，这与章力建 (1987)的观点相反。 通过对麦基一号、 2多种培养基的比较（章力建， 1987；曾寒冰， 1998），表明 在小麦幼胚愈伤 组织中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 诱导及继代培养方面一般只要 1962） 成份及在 -2 L 2,4睿辉等， 2001），当 2,4着 2,4麦盾片愈伤组织诱导率提高，当 2,4性能 愈伤组织的诱导效果最好，高于 2何花榕等， 1994)。 对激素 睿辉等， 2001），激素 时 激动素对胚胎发生及分化并非必须，水解酪蛋白有利于胚性愈伤组织生长 （ 叶心荣等， 1990） 。 ，但它又能诱导乙烯的生成，对愈伤组织的形成和胚性愈伤组织的发生产生负效应，加入 1987）。 小麦幼胚培养的分化阶段一般以 有时加一定量的细胞分裂素，其它成份的添加与更改对培养效果的影响则取决于具体的实验系统及所使用的基因型（ 1990） 。1987）研究表明，分化阶段培养基中附加较高浓度的细胞分裂素与较低浓度的生长素，能促进多数品种愈伤组织快速分化出绿苗，当 生长素处于同一水平时，对细胞分裂素 余桂荣（ 2003）对分化出的幼苗在生根培养基上进行生根培养，结果表明各基因型的再生苗在适宜的生根培养基上生根都不难，认为小麦幼胚离体培养成功的关键是抓好前期胚性愈伤组织的诱导和分化工作。 胚龄对愈伤组织发生的起始部位和强 度有明显的影响， 2周龄胚为盾片， 3周龄胚和成熟胚均为胚根鞘。 3周龄至成熟胚的盾片不形成愈伤组织，仅起转化，吸收和运转养分的作用 （关畅等， 1993） 。 研究表明 （蔡 体树等， 1989） ，小麦幼胚愈伤组织的诱 导频率与植株再生率为两个独立的遗传性状，而 1989）认为， 愈伤组织的诱导率与再生能力可能有部分连锁关系。在小麦幼胚培养能力所涉及的染色体作用研究中， 1986）和 1987）发现国春幼胚培养能力的促进作用，同时还发现其它几个品种的 4986)对 筛选出的 愈伤组织生长率和再生率均很 高） 的 研究指出，可能有一对或两对显性基因与一些加性修饰基因控制着 株再生率。 1987）研究发现除 3989)研究表明， 2键染色体， 控制愈伤组织再生能力的 主基因位于 27 6A、 3B、 5B、 5D 和 6饰基因， 2， 2 目前，小麦幼胚培养已被广泛应用于小麦遗传育种的以下方面： 远缘杂种幼胚拯救： 1973）首次应用赤霉酸溶液刺激子 房和受精卵发育，接着对小麦大麦杂种幼胚在人工培养基上拯救成功 ,这一技术解决了远缘杂种胚早期败育的问题，也为远缘杂交技术开辟了新的思路。孔令让等（ 1999）获得了对小麦白粉病有免疫能力，对条锈、叶锈和秆锈表现良好田间抗性的 二倍体 (质资源。通过远缘杂交与幼胚培养结合，李洪杰等（ 2000）创造出抗白粉病小麦一蔟毛麦的易位系；迄今和小麦杂交成功的物种数已经超过 100 个（崔国惠等 1996），组织培养技术扩大了种属间的杂交范围，为小麦育种工作提中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 供了可利用的优良资源。 获取单倍体植株： 米杂交中玉米染色体被迅速丢失，结合幼胚培养获得了仅有小麦染色体的单倍体胚及单倍体植株。孙敬三等 (1995)利用此方法也获得了小麦单倍体，陈新民等 (1998)对此方法做了改进，提高了获得单倍体的频率。 诱导体细胞无性系变异： 1984)对一个墨西哥小麦品种的组织培养中获得的 再生植株，无论形态还是生化性状的无性系变异均可稳定遗传，这些突变性状受单基因或多基因控制。从变异性状来看，突变的发生包 括隐性突变 (芒、粒色 )和显性或共显性 (颖壳 颜色、麦醇溶蛋白 )。大多数变异在 也有一些为纯合突变。 1987)在无性系后代的株高、每穗粒数、粒重、产量、总干重和收获指数上也观察到明显的变异。 曾寒冰等 (1991)对小麦幼胚再生植株后代 (研究表明，株高倾向于变矮，熟期倾向于早熟，后代丛矮病 的田间发病率低于对照，而穗粒数、穗粒重和千粒重则大多变劣。刘锦红等 (1997)对通过小麦单细胞和幼胚选育的再生植株第 7、 8代的籽粒蛋白质含量和干、湿面筋含量分析表明，它们的变异在遗传上是稳定的。胡尚连等 (1998)对表型稳定的小麦幼胚无性系再生植株 谷蛋白亚基和蛋白的 含量测定表明，体细胞无性系间存在着较大的变异；另外以作物病原菌致病毒素为选择剂，应用离体生物技术培育抗病种质也取得了较大进展 (王敬三等， 1990； 陆维忠等， 1991)。 遗传转化：小麦幼胚可作为原生质体培养、基因枪转化以及农杆菌转化的受体材料（ et 1992,1993； et 1993；刘文轩等， 1994；王兰岚， 1995； et 1997；傅荣昭等， 1997； et 1999；陈梁鸿等， 1999；徐惠君等， 2001；叶 兴国等， 2001a， b），并已获得了转基因植株。虽然幼胚是目前小麦遗传转化的主导受体，但由于小麦幼胚培养具有很强的基因型依赖性，且受季节限制，因此利用小麦幼胚进行大规模遗传转化仍受到一定的限制。 麦成熟胚培养 小麦 成熟胚培养因取材方便、数量多、离体培养不受季节、时间限制等优点，引起了一些研究者的兴趣（ et 1990；廖祥儒等， 1999；柯遐义等， 1995；柳建军等， 1996；明凤等， 2000；唐宗祥等， 2001），并取得一定的进展， 包括对成熟胚进行预处理（ 廖祥 儒， 1999） 、调节培养基中各种营养成分 （彭朝华， 1989） 、调节诱导培养基和分化培养基中的激素种类和配比浓度 （ 2002） 以及优化培养条件（ 李红潮， 1990） 等。 基因型是影响成熟胚培养的重要因子， 小麦成熟胚离体培养基因型间的出愈率和愈伤质量存在差异（ 李红潮， 1990； 柳建军等， 1996；明凤等， 2000；梁静静等， 2003），说明基因型的选择对愈伤组织的诱导是很重要的。但蔡体树等 (1989)研究表明， 不同基因型小麦之间诱导愈伤组织的能力差别不大。 激素对于愈伤组织的形成和分化也起着重要作用 （吴丽芳等， 2000）， 冬小麦成熟胚的脱分化在很大程度上受外源生长素浓度的影响（廖祥儒等， 1999）， 但是在使用激素浓度和种类方面，研究结果却有很大差异（ 柳建军， 1996；于晓红， 1999；杨淑慎， 2002； 2002； 003） 。 低温和 预处理效果又因小麦品种不同而有差异（廖祥儒等， 2000）。 由于成熟胚带菌多，接种易污染、胚胎易直接萌发成苗、愈伤组织质量差难以再分化、基因型差异等缺点（柯遐义， 1995；柳建军等， 1996；廖祥儒 等， 1999和 2000），小麦 成熟胚培养 在中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 遗传操作上的应用还较少。随着这方面技术研究逐渐成熟，必将对转基因小麦的进程起着很大的推动作用。 麦幼穗培养 1977 年 小麦幼穗为外植体成功诱导出愈伤组织， 1982 年 et 于小麦幼穗取材方便，周期较短，容易灭菌， 是进行组织培养的一个很好的外植体来源，引起国内外学者的重视（ 刘思衡， 1994； 伍碧华， 1996） 。研究主要集中在小麦幼穗组织培养中基因型、发育时期、培养基成分等因素的影响方面（舒 理惠， 1982；颜昌敬等， 1985；肖海林等，1989）。 关于小麦基因型的作用有两种不同的意见。多数学者 在小麦幼穗培养中均发现了基因型的明显影响 （ 1982； 1983； 1985；刘瑞凝等， 1986； 王培， 1989；曾寒冰等， 1989； 伍碧华， 1997； 李书平等， 1998； 吉前华等， 2004） ,而 肖海林等 (1989)认为基因型间的成愈率没有差异 ,但愈伤组织的生长状况和再分化率有显著的差异，基因型的差异在各种培养基中具有相对的稳定性 ,但少数效果较差的基因型仍 可找到与之相适应的良好的培养基。 但也有学者认为基因型对离体培养的效果影响不大（ 颜昌敬等， 1985）。 不同发育时期的幼穗也在一定程度上影响组织培养效果，但影响力远不如基因型大（刘建平，1993）。舒理慧（ 1982）和刘瑞凝等（ 1986）认为，小麦幼穗离体培养中，诱导率与分化率最高的时期为护颖分化期。肖海林等（ 1989）认为，护颖分化时期很差，小花分化时期居中，而以雌雄蕊分化时期最好，分化率和得苗率均较高。王培（ 1990）认为， 且有较高的分化 率，但主要是分化根，而分化正常绿色植株的频率较低， 00%，而且分化正常绿苗也较多。 何勇刚等（ 2001）对 究结果表明， 培养基对小麦植株再生能力的影响也有一些研究， 1990） 研究发现 在小麦幼穗、幼胚愈伤组织诱导及继代培养方面一般只要 2,4其中附加的 2,4外植体在 2,4基上较易脱分化形成胚性愈伤组织（ ,而 ,4转移到无激素培养基上才能够再分化出完整植株等现象说明必须在足够长的时间里，经过外源生长素对内源生长素的补充和调节，才能保证体细胞中有适量的生长素用于启动细胞分裂和胚性潜力的诱导以及促进体胚的早期发育 (李 雪梅 ,1994)。 权军利（ 1999）以 果表明较高浓度的 2,4)有利于愈伤组织的形成与生长，但低浓度的 2,4)更有利于胚性愈伤组织的形成及 生长；蔗糖有利于小麦胚性愈伤组织的形成，在 度范围内，随蔗糖浓度的提高，胚性愈伤组织的形成率也随之提高。 对活力高和生长旺盛的软块型愈伤组织 ,添加 的 郎明林 ,2001) 。小麦幼穗培养 本培养基中不宜添加 或尽量添加低浓度的 ),的 蒋有绎等 ,1996)。 小中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 麦幼穗诱导培养基中加入适量的 生物素 ()和水解酪蛋白 (250)有利于提高愈伤组织的质量 (王培 ,1989)。 小麦幼穗培养分化培养基上不需要补加激素之类的物质，就能很快地分化具有根、芽的再生植株，这说明小麦幼穗形成的愈伤组织内源激素含量较高，不需要补加外源激素（舒理慧， 1982）。 吉前华等（ 2004）对成芽愈率和成根愈率的关系进行了研究，结果表明二者的变异不平行。染色体定位 研究表明（ 1994； 1995；肖兴国等， 2000； 吉前华， 2004），成芽愈率主要与第二同源群的染色体有关，而成根愈 率主要与第三同源群的染色体有关，成根愈率和成芽愈率相关性较低，它们有不同的遗传基础，且出愈及分化速度与材料的熟期早晚无关（ 曾寒冰 1989）。 小麦幼穗诱导体细胞胚为间接发生，且多为外起源，即 愈伤组织表层或近表层的薄壁首先被启动，进行 着这些细胞迅速分裂 ,进入体细胞胚发生的各个时期，这些薄壁细胞的启动是体细胞胚发生的必要条件。 但体细胞胚的发生既有来自于单个胚性细胞的 ,也有可能来自于多个胚性细胞或分生细胞团 ,经细胞分裂和分化而形成体细胞胚（王晓哲等， 1996）。 幼穗培养在 小麦育种中主要用于 扩大远缘杂交后代，建立起一些珍贵材料的无性 系，在育种学上具有重要的意义。 朱至清等 (1985)从小麦 杂种后代幼穗外植体愈伤组织再生植株中获得了变异植株；王关林等 (1995)从小麦 到了变异植株；陈孝等 (1996)对硬粒小麦 /簇毛麦杂种幼胚和幼穗诱导的愈 伤组织进行秋水仙素处理，获得了硬一簇双二倍体 过与普通小麦 回交再结合幼胚和花药培养，得到了 6D 6。 幼穗培养也可获得体细胞无性系变异， 为小麦育种 和遗传学研究创造新的变异来源。郑企成等（ 1989）报道不同基因型间幼穗在 (当代 )中的变异存在明显差异。 刘思衡等 (1997)以小麦幼穗 为外植体，在含有赤霉菌毒素的培养基上进行离体 筛选 ,获得抗病的体细胞无性系；张怀刚等 (1998)对小麦幼穗来源的 体细胞无性系 和 进行了 淀值测定分析，发现 存在广泛的变异，并且高 淀值变异是可以遗传的。 陈耀锋等 (1998)通过普通小 麦幼穗离体培养，建立起了 2 个小麦体细胞无性系， 以禾谷镰刀菌的粗毒素为选择剂，应用多步筛选方法，从2 个体细胞无性系中分 离出了 5 个对镰刀菌毒素有较强抗性的变异细胞系，从 3 个抗性变异细胞系中获得了再生植株。 吉前华（ 2004）在小麦幼穗离体培养再