【毕业学位论文】胸膜肺炎放线杆菌毒素IV 基因的克隆表达及间接ApxIVA3－ ELISA 方法的初步建立毕业论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 胸膜肺炎放线杆菌毒素 法的初步建立 of an 士研究生：石 琴 指 导 教 师：逯忠新 研究员 申请学位类别：农学硕士 专 业：预防 兽医学 研 究 方 向：细菌分子生物学 培 养 单 位：研究生院 兰州兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 of an s. P r o f. L u Z h o n g x i n P r e v e n t i v e V e t e r i n a r y S c i e n c e 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指 导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 （此页请复印论文答辩会上专家签名的一份 !） I 摘 要 猪传染性胸膜肺炎（ ，是由胸膜肺炎放线杆菌（ 起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。大量研究工作证实，生的溶血外毒素是其最重要的毒力因子和主要的保护性抗原， 而只有毒素四（ 所有 15 个血清型都分泌的，因此对其进行研究具有很重要的意义。本试验旨在应用分子生物学技术，对编码 端的 分基 因片段在原核系统中进行表达，初步建立间接 法，为猪传染性胸膜肺炎的新型诊断方法的建立奠定基础。 本试验以提取的猪胸膜肺炎放线杆菌血清 8 型菌株基因组 模板， 用 异性基因片段，物经纯化后与载体 18行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆到原核表达载体 ，构建成重组表达质粒 列分析结果表明: 405 菌株与标准 8 型基因同源性达 。 将重组表达质粒到大肠埃希氏菌 ，以 行诱导重 组蛋白的表达， 测 结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为 18与预期片段大小相符；将经过超声破碎的菌液离心取沉淀经尿素洗涤溶解后用镍金属螯合层析柱进行纯化。 析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。在经过变性、复性及纯化后，将 合蛋白作为抗原,以 染猪阳性血清作为抗体初步建立了间接 法，结果证明 合蛋白可以特异的与感染猪血清结合，而和免疫猪血清和阴性猪血清无论抗原抗体何种浓度都不能发生反应，说明 合蛋白具有很好种特异性和生物学活性，可以 用于胸膜肺炎感染的鉴定及区分感染猪和免疫猪，有很好的应用前景。 关键词 胸膜肺炎放线杆菌， 隆表达，蛋白纯化，间接 法 he is of of in px is is by of . at 440in by an a PP in NA by CR 100g/ml)of to on a W at by is as . as . in PP be to to 录 第一章 绪 言 . 1 膜肺炎概述 . 1 膜肺炎研究进展 . 1 原学. . 膜肺 炎放线杆菌的主要毒力因子及其致病性 .行病学 . 8 染源 . . 传播途径 . . 易感动物 . . 流行特点 . .理变化 . 10 急性型. . 急性型. . 亚急性型 . . 慢性型 . .要临床症状 . 11 急性型 . . 急性型. . 亚 急性和慢性型. 断 . 12 床诊断. . 实验室诊断 . . 分子生物学诊断. 鉴别诊断. . 16 第二章 胸膜肺炎放线杆菌 因的克隆表达及纯化 . 19 料 . 19 种和质粒. . 酶和试剂. . 仪器与设备. .法 . 19 因组 提取 . 19 因的扩增 . . 因的克隆 . . 重组质粒的提取和鉴定 . 重组表达载体的构建 . 重组表达质粒的诱导 . 表达产物的检测 . 23 析 . . 达蛋白的初步纯化 .果 . 27 物的电泳结果 . 27 因的克隆与鉴定 . 重组表达载体的构建及鉴定 . 表达产物的检测. 表达产物的初步纯化 .论 . 32 关于利用 备新型诊 断试剂的研究. 大肠杆菌中的表达 . 表达产物的初步纯化.结 . 33 第三章 间接 法的初步建立 . 34 料 . 34 原和阳性血清 . 34 剂和耗材. . 所需溶液的配制 . 35 法 . 35 接 法条件的优化 . 间接 法的操作程序. 间接 法 阴阳性临界值的确定. 敏感性试验 . . 特异性试验. 重复性试验 . .果 . 37 接 法 最佳工作条件. 间接 法 阴阳性临界值. 敏感性试验 . 40 .重复性试验 .论 . 42 第四章 全文结论 . 44 参考文献 . 45 V 致谢 . 52 作者简历 . 53 V 文缩写 英文全称 中文名称 g 克 l 升 膜肺炎放线杆菌 膜肺炎放线杆菌 毒素 基对 血清白蛋白 体结合试验 落形成单位 膜多糖 d 氧核糖核苷三磷酸 硫苏糖醇 联免疫吸附试验 原型谷胱甘肽 化型谷胱甘肽 胱甘肽 h 时 根过氧化物酶 丙基硫代 道尔顿 克 钟 密度 膜蛋白 丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 合酶链式反应 分钟转速 二烷基磺酸钠 铁结合蛋白 LB B 培养基 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪言 1第一章 绪 言 膜肺炎概述 胸膜肺炎放线杆菌( 原称胸膜肺炎嗜血杆菌(p),属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，后又根据其表型（ 交水平均与放线杆菌属模式密切相关，故归属于巴氏杆菌科放线杆菌属，更名为胸膜肺 炎放线杆菌。由本菌引起的猪接触性传染性胸膜肺炎(一种以肺脏出血坏死以及纤维素性胸膜粘连为特征的猪急性或慢性呼吸道传染病。由病各种年龄的猪均易感，具有较高的发病率和死亡率（100%， 致死率0 100%） ，并常与巴氏杆菌等混合感染。由于该病带来的猪只死亡、生长缓慢、饲料报酬降低及药物 防治费用的增加，给世界各地的养猪业造成了严重的经济损失，已成为当今大型 养猪场的三大呼吸道传染病之一，其余2个为猪传染性萎缩性鼻炎和猪气喘病。 膜肺炎研究进展 病原学 （1）发现历史 1957年，奶牛工人于英国首次发现并报道了本病，当时将本病称为胸膜肺炎嗜血杆菌( 981)。1963年，报道了本病的存在。1964年，根据其培养特 性称之为副溶血嗜血杆菌，认为此菌即是猪传染性胸膜肺炎的病原菌（ 983） 。当时该菌认为是副流感嗜血杆菌( 副溶血嗜血杆菌( 胸膜肺炎嗜血杆菌( 的一种。但是经过糖类发酵实验证实，该菌不属于副流感嗜血杆菌( 因此，该菌有时被命名为副溶血嗜血杆菌（ 有时则被命名为胸膜肺炎嗜血杆菌（ 1978年，研究证明，从猪体内分离到的胸膜肺炎嗜血杆菌（ 与从人体内分离到的相比差异很大，并建议将该菌重新归类。因此，从猪体内分离 的该菌被命名为胸膜肺炎嗜血杆菌中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪言 2（ 。 1983年，研究人员进行的流感嗜血杆菌( 胸膜肺炎嗜血杆菌( 间并没有同源性，而胸膜肺炎嗜血杆菌( 李氏放线杆菌( 间却有很高的同源性。根据这一结果，将该菌划归放线杆菌属，命名为胸膜肺炎放线杆菌（ 983)。 （2）生物学特性 (a) 形态及染色特性 散在排列，无芽胞，初分离有微荚膜( ., et 982)，菌体 有周身菌毛，每菌平均有 为60450 人工培养在血液琼脂上易出现，其它培养基上不易见菌毛。菌毛数量随着人工传代数的增加而减少(廖延雄，1994)。菌体周围直纤毛长约130170径均25下(,982)。 (b) 培养特性及营养需求 长温度2042，最适生长温度为37，分离时供给5% 10% 长发育( ., et 985)。营养要求较高，在普通琼脂平板、普通肉汤内 不生长，最适生长的培养基为巧克力琼脂平板，加有 et 987)。 根据其生长是否需要克酰 胺腺嘌呤二核苷酸)，可将赖外源bi )，不需要I)。 此应用血液琼脂平板进行分离培养时，需在培养基上划一条葡萄球菌线，葡萄球菌产生较多的37，5%绵羊鲜血琼脂平板上培养24形成表面光滑、圆形、稍突起、边缘整齐，针尖大小的菌落，呈明显的一现象被称为“卫星现象”，而所生长的这些菌落则被称为 “卫星菌落”。生物37，24样呈靠近划线的菌苔溶血区就越大，形似杯状，这一现象称为C 000)。 24 长菌落比上述鲜血琼脂平板菌落稍大，形态相同；在含马血清的营养肉汤内培养24菌膜形成；在巧克力血琼脂平板上生长菌体比鲜血平 板上菌体稍大，随着传代次数增加菌体变得瘦小，形态不典型，荚膜消失，但从 感染病料及采集病料中可以观察到荚膜(, et 985)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪言 3(c) 抵抗力 本菌对外界环境条件抵抗力不强。60加热 15日光、干燥和一般化学消毒剂于短时间内即可被杀灭。在干草和秸秆上的生存时间不超过5d，对羧苄青霉素、卡那霉素、头孢拉啶等抗生素高 度敏感，对阿米卡星（丁胺卡那霉素）、红霉素、四环素、复方磺胺、氟哌酸、 壮观霉素等抗生素不敏感。绵羊血琼脂斜面上生长菌48可保存20 25d,存 菌培养物，保存时间为68个月(., et 985)。 (d) 抗原及血清型分类 多糖抗原、外膜蛋白、溶血素、粘附素等抗原(et 987)。根据荚膜多糖和脂多糖抗原性的差异，可以将目前为止，已报道的et 002)，生物包括血清1至12型和血清15型，其中血清型5分为5外，还有许多放线杆菌，根据其理化特性已确定为胸膜肺炎放线杆菌，但目前的分类系统却不能将它们定型 (003)。1996年，2:的荚膜 多糖与血清2型一致，但脂多糖却与血清7型一致，因此尚不能对此菌株定型 (et 995)。 各血清型之间的交叉保护性不强(宣长和等， 1996)，其中1，4，6三型之间有交叉反应；3，6，8三型之间有交叉反应，8型荚膜中含3型，6型的荚膜抗原，4型菌株与5型，7型有交叉反应(廖延雄等， 1994)。 胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子及其致病性 胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子有很多，其中主要包括脂多糖(、荚膜(外膜蛋白 ( 转 铁 结合蛋白(溶血外毒素（ 附因子、过氧化物岐化酶（脲酶（菌 毛等，这些毒力因子都能引起胸膜肺炎的发生（B ,1997）。 (1) 脂多糖(脂多糖是胸膜肺炎放线杆菌外膜的重要组成成分。 糖既是抗原又是内毒素，同时也是良好的有丝分裂原。其毒力是由许多因素决定的，分离的菌株、提纯的方法、制剂的纯度以及使用的培养基，都会影响物学活性以及免疫原性（ et 995）。 有一定的毒力。质终导致组织损伤。脂多糖内毒素并不是一个经典的毒力因子，但在 病方面也起到了一定的作用；脂多糖内毒素可以刺激机体的防御系统，活化 巨噬细胞，排除感染菌；还能引起同没有典型的出血性坏死，而且引起病变需要大量的986）。原性很弱，刺激产生的 第一章 绪言 4抗体，只能抵抗发病，不能抵抗感染，但具有血清型的特异性，只能对 ,et 1997)。 提纯的脂多糖能对肺组织造成损伤，但这种损伤与因感染胸膜肺炎放线杆菌而形成的坏死的病灶及溶血的病灶不同。 强溶血素对巨噬细胞的毒性作用，以及( et 995)。 (2) 荚膜多糖(荚膜多糖是够抵抗正常血清的杀菌作用以及调理活性，型特异性抗原甚至株特异性抗原就存在于荚膜上，是化学结构主要是由五碳糖、六碳糖及类脂.990)。 不同血清型的 不同，这与荚膜也有一定关系。荚膜厚的血清型毒力往往较强(et 986)。 另外，菌株产生荚膜的数量、荚膜的类型以及荚膜分泌机制与说明荚膜是 (3) 外膜蛋白(外膜蛋白也是胸膜肺炎放线杆菌的一个重要毒力因子，针对et 991)，因而重要的保护性抗原。一般认为在们是巴氏杆菌家族所共有的。9，这种差异可能与实验菌株、分离方法、实验操作及材料配备有关(et 986)。 具报道图谱是菌株最稳定的特征，可以用来作流行病学调查，而且相近血清型间能反映了演化上的关系。考虑到外膜蛋白可能具有种的或型的特异性，可能会是很好的抗原于是 验结果表明用40疫的猪可以抵抗同源菌株的攻击，(.988)但也 存在着肺损伤的现象，说明et 993)。 (4) 转铁结合蛋白 (铁对细菌的生长是必不可少的，但是由于宿主糖蛋白、转铁蛋白及乳铁蛋白的络合作用，细胞外环境中的铁是很少的。有 证据表明放线杆菌、嗜血杆菌以及巴氏杆菌属的一些细菌有一种获得铁的机制，即在其表面存在着转铁蛋白的受体，当铁缺少时，这种受体就会被表达出来( 989；989)。它由两种不同的蛋白构成，即转铁结合蛋白1 ( 转铁结合蛋白2 ( 它们对宿主的转铁蛋白具有特异性。管道一样把铁运送到膜内，残基镶嵌在外膜上。Ki 995)等描述了过 协同作用，捕获宿主的转铁蛋白，通过 可在一定程度上解释细菌对宿主的特异性。 通过对清型的检测， 鉴定了三种分子量分别是 6062 第一章 绪言 5及6560，et 2000)。 (5) 溶血外毒素（ 的毒力因子（ et 1994;995）。不 分泌或缺失失株补充了构和分泌基因后可恢复原来的毒力（ et 1991;et 1994；et 1995 ）；而且et 1997）。 目前为止已经发现胸膜肺炎放线杆菌可以产生4种毒素，它们具有溶细胞作用和溶血活性，属于细胞孔形成蛋白家族的含重复子毒素in 族（et 1999）。般具有细胞特异和种特异的溶血性、白细胞毒性和白细胞刺激性等作用 (1998)。 为A 即et 993; et 999). 疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的（et 997）。这 三种毒素在体内和体外都能表达，对肺泡巨噬细胞、多形核白细胞（肺上皮细胞和内皮细胞都有不同程度的细胞毒性。et 002) 。大肠杆菌内的表达产物具有微弱的溶血活性，细胞毒性不清楚。为缺少 产生 et 994.） 不同血清型的 同的毒素，如血清型1，5，9，11产生 血清型2，3，4，6，15产生 数 血清型只产生一种血清型10只产生血清型7，12只产生A et 994）。血清型毒力的强弱与生 清型毒力最强。如果要产生和分泌具有生物活性的要相邻的按一定顺序排列的四个基因 基因编码结构毒素蛋白，和蛋白质连在一起的膜( et 002)。 (a) 05有很强的溶血活性，对肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞也具有很强的细胞毒性作用，血清型1，5，9，10和11型能表达并分泌它（张学明等，2001)。 在胸膜肺炎放线杆菌中产生、激活并分泌有活性的A 操纵子的调控，该操纵子包括四个基因：A 码毒素蛋白的前体， 码毒素翻译后的激活物， 的产物负责毒素的分泌。这是一个典型的1998)。 在血清型1，5a，5b，9，10和11中，存在完整的们产生具有强溶血和强细胞毒性的 临床上具有严重肺损伤和高死亡率的 第一章 绪言 6般都是由1，5