【毕业学位论文】交链孢菌cDNA文库构建及激活蛋白基因克隆与融合表达硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 交链孢菌 库构建及激活蛋白 基因克隆与融合表达 of of 研 究 生：张 宁 指 导 教 师：邱德文 研究员 申请学位类别 ：理学硕士 专 业： 微生物学 研究方向 ：药物工程 培养单位 ：中国农业科学院研究生院 植物保护研究所 提交日期 2006 年 6 月 F of of 006 基金来源声明 本学位论文是国家“863” 计划（项目编号：2003和国家“ 973”计划自然科学基金（项目编号： 2003部分内容。 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 交链孢菌 库构建及激活蛋白基因克隆与融合表达 论文作者 张宁 指导教师 邱德文 培养单位 植物保护研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 裘季燕 研究员 硕导 博导 北京市农林科学院植保环保所 植物病理学评 阅 人 王 琦 副教授 硕导 博导 中国农业大学 植病生防 答辩 主席 成卓敏 研究员 硕导 博导 中国农业科学院植物保护研究所 生物技术 谭华荣 研究员 硕导 博导 中国科学院微生物研究所 微生物 简 恒 教授 硕导 博导 中国农业大学 植病生防 杨怀文 研究员 硕导 博导 中国农业科学院植物保护研究所 害虫生防 答 辩 委 员 朱昌雄 研究员 硕导 博导 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 微生物 答辩时间、地点 2006 年 06 月 16 日下午中国农业科学院中日中心大楼 305 会议室记 录 杨秀芬 副研究员 摘 要 激活蛋白是从多种真菌中筛选、分离、纯化出的一系列新型蛋白质。对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫都有较好控制效果，并能提高作物的抗旱能力和提高作物产量，具有较好的应用开发前景。激活蛋白基因的克隆是构建高效工程菌菌株、研究作用机理、分析结构与功能域研究的重要基础，本文以激活蛋白产生菌交链孢菌为材料，用基于噬菌体特异位点重组反应构建定向技术，首次成功构建交链孢菌门文库和表达文库，进行基因表达与纯化研究，为交链孢菌的分子生物学研究提供了良好的遗传背景，同时为激活蛋白的结构与功能的进一步研究奠定基础。对揭示激活蛋白的作用机理以及蛋白药物的分子设计具有重要意义。 1. 利用术，首次成功构建了交链孢菌门文库和表达文库。构建的门文库经检测， 入门文库的滴度达到 6106， 文库总容量为 07，其阳性克性率为 100%，平均插入片段大小大约为 过 达文库的滴度为 106，文库总容量为 06，其阳性克性率为 100%，用激活蛋白抗体筛选文库克隆其编码基因提供基础。 2. 成功地利用免疫学方法筛选 达文库，筛选和克隆到一段包括起始密码子和终止密码子在内的 882完整编码序列，该核酸序列推测的氨基酸序列与已有的35白的质谱测定所得肽段序列相比有较高的相似性。通过 索未发现相似序列，认为该蛋白为一种新功能蛋白。 3. 成功进行了激活蛋白基因的融合表达与纯化。用含 动子和 列的 体和 主菌高效表达了此基因的融合蛋白，并进行了亲和层析纯化。获得了分子量大小为 32融合表达蛋白。 关键词：交链孢菌，激活蛋白，库，术，免疫筛选I is a of is a to of MV MV,it s to of on is a of on a a an in on of a on of of it of on a of 1. a 106a 07,in 00% of In to we R to to a 06a 06,in 00% of 2. A 82bp of of it to 5kD of no of 0% so its a 3. 2kD 7 ag to it by by 目 录 第一章 文献综述 . 1 白激发子的作用特点与生物学功能. 过敏反应及过敏蛋白（ . 隐地蛋白（ .活蛋白（ .因克隆技术研究进展.隆已知多肽分子的基因 . 克隆已知序列基因家族新成员 . 克隆已知生物活性的新分子 .3 . 固相. . 逆转录病毒达系统构建. 利用体外特异位点重组反应构建. 文库筛选的方法 .究目的与意义.究内容、方法和技术路线.究内容：.究方法和技术路线 .二章 交链孢菌株门文库的构建 . 13 验材料 .株 . 试剂、酶及载体 . 仪器 .验方法.验菌株的培养 . 器皿的处理. .果与讨论.取和化 . 链合成及片段分级 . 入门文库质量检测 .三章 交链孢菌 . 26 验材料.要试剂、酶及载体 . 主要实验仪器及耗材 . 实验中主要溶液的配制 . 验方法. 达文库 . .果与讨论.建表达文库及文库质量的评价 . 免疫筛选.四章 阳性克隆的鉴定与重组表达载体的构建 . 31 验材料.要试剂、酶及载体 . 主要实验仪器及耗材 .验方法.性克隆的鉴定 . 重组表达载体的构建 .果与讨论.性克隆的质粒鉴定 . 阳性克隆的序及序列分析 . 组质粒的质粒鉴定 . 表达体系的选择 . 重组表达载体的质粒鉴定 .五章 目的基因的表达与纯化 . 38 验材料.要试剂、酶及载体 . 主要实验仪器及耗材 . 实验中主要溶液的配制 .验方法.的基因的诱导表达 . 表达蛋白的纯化 .果与讨论.的基因的诱导表达 . 表达蛋白的亲和层析纯化 .六章 结论 . 44 参考文献 . 45 致 谢 . 50 作者简历 . 51 缩 略 词 缩略词 英文名称 中文名称 苄青霉素 卡那霉素 bp 基对 氧核糖核苷酸 EB 化乙锭 丙基硫代- 乳糖苷 kb 碱基对 钟 合酶链式反应 分钟转速 二烷基磺酸钠 养所得菌簇形成单位 -(1 氯哚- -(环已胺)磺酸 V 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 第一章 文献综述 白激发子的作用特点与生物学功能 蛋白激发子是一类能激发植物防御反应基因表达与过敏性反应的特殊信号蛋白活性物质。植物在抵御病原菌侵害的过程中，关键环节是病原菌与寄主的相互识别及其随后诱发的一系列防卫反应( et 2002) 。植物通过细胞表面或亚细胞表面的受体分子与病原菌的蛋白激发子结合，启动级联信号系统，活化防卫基因的表达，最终表现对病原菌的抗性( et 2001)。蛋白类激发子作为一种新型微生物蛋白农药具有一般农药所不具备的特点和优势，一般生物农药是直接作用于防治对象，而基于蛋白激发子的新型微生物蛋白农药则是通过诱导植物本身的抗病基因表达而达到抗病防虫促进生长的作用，是解决农业生产病虫害问题的根本途径。主要的蛋白类激发子有：过敏蛋白（、隐地蛋白（和激活蛋白（。 敏反应及过敏蛋白（ 过敏性反应 (R)是植物基本的抗病反应，指植物受病原侵染后，病原侵染点周围细胞迅速坏死的一种现象，是植物病原互作系统的抗病反应 (et 1994)。早在 1902 年 究的雀麦冠锈病中就已发现过敏反应。二十世纪三十至五十年代，人们在研究病毒鉴别寄主和研究专性寄生菌致病性分化的鉴别品种上发现有枯斑反应。1964 年，人发现革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主植物上有过敏性反应。 1970间， 现称为系统获得抗性( 寄主植物感染病原物后，引起感染部位组织坏死，限制病原物的扩展 (et 1996; 1996)。其表现形式可从单细胞坏死到明显的组织大面积死亡(.1994) ，这主要取决于植物病原互作系统，有时也受环境条件的影响(et 1996) 。过敏性反应 (起植物组织细胞的死亡类似于动物程序性细胞死亡( 1996; et 2001)。抗病作用不仅仅是表现在对病原菌扩展的限制，而且能诱导植物的系统获得抗性，抵抗多种病原的侵染（李汝刚等， 1998）。 接着聚集植物抗毒素以及其它因子（章元寿， 1996）。 1) 由寄主的抗性基因和病原互补的无毒基因的直接或间接产物相互识别诱导产生；2) 由植物病原细菌在非寄主上诱导产生(et 1991)。随着分子生物学和其它相关学科的发展，人们从信号识别、信号传导和防卫基因表达调控等环节上对诱导抗性机制有了深刻的认识（王钧， 1995） 。人们发现病原真菌的非亲合小种能诱导植物合成抗病物质，从而提出了激发子 (概念。从来源上讲，激发子又可分为生物激发子和非生物激发子两大类。非生物激发子包括一些非生物来源的化合物（如水杨酸、核黄素等） ，某些金属离子如 也具有激发子的功能，生物激发子指来自病原菌、非1 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的物质（梁元存等， 2001）。 细菌激发子范例，这一发现促进了寄主病原物相互作用的研究（王金生，1999; 梁元存等，2001; .1992 ）。 白及其基因研究 1992 年，美国 学韦忠民博士等人报道了植物病原欧氏杆菌 因，他们从梨火疫病的病原细菌中分离到一种由 因编码的约 44激发 蛋白类激发子 用 示) ，并首次提出 发植物 抗病性的关系，文章提出了过敏蛋白具有诱导抗病性功能，从而促进了新型微生物蛋白农药的研究(et ， 1992)。自 1986 年首次报道 因以来，人们对植物病原细菌 因的分布、结构、功能等进行了大量研究。目前,从各类病原菌中寻找产生 因及研究 导防卫机制已是分子植物病理学的一个研究热点（杨竹平等, 2000 ）。 植物病原菌都有 因簇，包括 3基因，它们既和致病相关，又与诱导寄主的过敏性反应相关(. 1991)。 因簇既能诱导非寄主植物产生 .， 1963)，又可使寄主植物致病(. 1997)。 因簇的主要功能是编码组成型分泌系统(1998; et 1999)，有些 因产物，如 可在非寄主植物上激发 诱导 同一属的病原细菌产生的 白在核酸和蛋白质序列上具有一定的同源性，如 相似性、的同一性， a 具有 相似性和 同一性，特别是靠近 C 端约 50%的部分，具有 90%以上的相似性和同一性(et 1995)。 白的作用机理及生物学功能 白并不直接作用于靶标作物，而是刺激作物产生自然的免疫机制，使得植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒病害。其作用机理是激发子与植物的受体识别，通过构型变化激活胞内有关酶的活性和蛋白质磷酸化，形成第二信使，信号得到放大，最终通过对特殊基因的调节而激发植物产生防卫反应（梁元存等，2001 ）。 激发子以激活阿布属(植物中两种介导适应性反应的酶. et 1999; . et 2001)。具有调节离子通道如K+/H+ 跨膜交换、引起防卫反应和细胞死亡的功能(. et 2001) 。此外， 引发细胞程序性死亡(，表形为. et 1998; . et 1999)。已证明活性氧有三方面的抗病功能:(1) 传递诱导防卫反应的互作信号； (2)修饰寄主的细胞壁以抵御病原菌的侵染； (3)直接抑制病原菌的侵入(. Y. et 1993)。对 报道烟草细胞壁上存在结合位点(et 1996)。美国 植物中发现了结合蛋白 1(,一种与现有任何已报道的蛋白质不相似的新蛋白，由 284 个氨基酸残基组成，分子量约为 30 12 种植物的研究表明，不同植物中存在类因。 类白质序列比较表明，类白与存在高度相似2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 性，保守的相似区可能包含与结合的蛋白部分。由于植物中广泛存在，有助于解释多种不同作物上均有效果的现象。 合后，会激活多种防卫反应信号传导，从而使植物产生防卫反应。其激活植物防卫反应的途径主要有三种:(1) 一种未知途径激活植物抗细菌反应；(2) 水杨酸途径激活植物的抗细菌/ 真菌/ 病毒反应； (3)乙烯和茉莉酸途径激活抗真菌反应(. et 1999; . et 1998)。 地蛋白（隐地蛋白是由隐地疫霉(分泌产生的蛋白类激发子。 ( G,et 1997 ； M. et 1995) 将从隐地疫霉、樟疫霉(和辣椒疫霉(P. 中纯化的分子量约 10多种蛋白类激发子命名为 地蛋白是一类特殊的外泌、小分子耐热蛋白, 等电点为 由 98 个氨基酸组成( M. et 1995;. et 1993) 。可诱导茄科的烟草和十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死和诱导抗性等防御反应。迄今已发现 17 种疫霉菌中存在 性蛋白, 根据等电点和对烟草的激活反应可分为酸性) 和碱性) 两类, 两种类型蛋白的氨基酸序列同源性达到 60%以上。 近年来从一些腐霉菌中也发现有 活性蛋白存在, 并能高效激发番茄的系统获得性抗性( 王钧等, 1995） 。 因隐地蛋白在极低浓度(100就能诱导烟草产生 并使植株获得广谱抗病性，同时产生与防卫反应相关的物质如乙烯、植物保卫素、 白(等( L . et 1991),所以倍受植物病理学家和育种工作者的重视, 并得到了较为系统的研究, 在氨基酸序列、空间结构、寄主与非寄主抗病性、作用机理、作用靶标、结构与生物活性的相关性以及抗病基因工程等方面取得了较大的进展(1999; O et 1995; et 1997)。法国的 首次将隐地蛋白基因成功导入烟草, 植株表现抗黑胫病作用。 白结构与特点 基酸序列高度相似和保守, 蛋白质前体含 19 或 20 个氨基酸的信号肽 , 成熟蛋白质一般含 98 个氨基酸, 分子量一般为 10 少数 有不同。已证实 的 37 个种、 的 2 个种共产生 40 种 多数卵菌产生的 有或一种类型, 但致病疫霉(等 7 种卵菌分别产生与两种类型的了致病疫霉产生的两种 ) 与型诱导 能力相同, 其他所有型 生物活性都高于型。通过比较 2 种型 与 2 种型 的结构发现, 型第 13 位的氨基酸是缬氨酸, 型在此位上是赖氨酸。 6 个保守的半胱氨酸形成 3 对二硫键, 使 球状。核磁共振和晶体结构的解析表明, 有一种特殊的折叠方式, 有 6 个2 螺旋, 一个反平行的2 折叠和一个2 环, 而且此蛋白还具有一个疏水性口袋状的构象（, et 1996 ）。两条链的 C 端形成一个功能单元(, 具有磷酸脂酶的结构特征 (半胱氨酸配对形成三个二硫桥) 。在这个结构中, 决定 导能力的第 13 位氨基酸暴露在外, 可能在对相应受体识别中起作用。 3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 白的生物学功能 此类蛋白质能引起烟草(发生防卫反应，并可诱导产生 系统抗性以免进一步感染(1996; 1996) 。可诱导茄科的烟草和十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死和诱导性抗性等防御反应(1997; 1993; 1998)。极低浓度(100下就能诱导烟草产生 使植株获得广谱抗病性，同时产生与防卫反应相关的物质如乙稀、植保素 (病程相关蛋白(1999) 。 用 理烟草、番茄、莴苣、甘蓝、黄瓜、茄子、辣椒和拟南芥等 61 种植物, 结果发现两种 烟草、萝卜和芜菁植物上产生 在其它植物上则不能，表明 一种特异性激发子（1993）。 研究证明，通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等病原物的系统抗性(同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植保素(、病程相关蛋白(等防御反应相关物质。和两种类型蛋白引发可见防御反应所需的浓度有很大差别，碱性低于 100浓度即可引发可见反应，而酸性. 起可见反应的浓度为 10 . et 1989)。近年来从一些腐霉菌中也发现有似活性蛋白存在，并能高效激发番茄的系统获得性抗性(（王钧， 1995） 。法国的 (1998) 首次将隐地蛋白(基因成功导入烟草， 株均表现抗黑胫病作用。 活蛋白（ 激活蛋白是从葡萄孢菌( 交链孢菌( 黄曲霉菌( 稻瘟菌(青霉菌( 纹枯病菌( 木霉菌( 镰刀菌(多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型的蛋白质。氨基酸和核酸序列分析表明其氨基酸和基因的序列完全不同于过敏蛋白和隐地蛋白，与蛋白质数据库中已知的蛋白序列均无同源性，属于一种全新的蛋白。邱德文博士根据其作用机理将此蛋白命名为真菌激活蛋白(该蛋白不激发烟草植株的过敏反应，这与 生物活性均是基于植物的过敏反应不同。其对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病害和蚜虫的防效在 75% 以上，并能促生增产；对辣椒、白菜和水稻增产效果显著，达到 10 对豌豆赤斑病和草莓蛇眼效果达 65 89%。激活蛋白诱导处理种子能够加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长；处理多种瓜果蔬菜均能提高其座果率，如处理西瓜和番茄可使瓜果数和果重显著提高，分别达到 和 （湖南宏利农业科技有限公司）；对灰霉病害的防效达 （湖南农业大学植保学院提供）；诱导植株抗青枯病的防治效果达 （文章待发表），长沙普绿通生物科技有限公司用激活蛋白可湿性粉剂处理桃子与西红柿，可减少桃子与西红柿灰霉病的发病率和烂果率，对桃子与西红柿具有保鲜作用。此外，激活蛋白能明显改善烟草、白菜和柑桔的品质。同时，还发现该蛋白制剂能够以特定的作用方式成倍的提高 鳞翅目害虫的防治效果，增效达 (中国农科院植保所提供) ，急性口服毒性试验结果表明：大鼠 830mg/中南大学湘雅医学院毒理学试验室提供) 。由此可见该种激活蛋白具有广泛的应用前景。该种蛋白质主4 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力；通过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的。 因克隆技术研究进展 分子遗传学在理论上的重大突破，以及 70 年代后限制性内切酶的发现，质粒作为载体的应用，共同推动了 外重组技术的发展，使分子的基因克隆成为可能。迄今，这项技术已不断地发展完善，不仅能用来克隆已知分子的基因，而且成功克隆了一些未知分子，从而大大推动了分子水平的研究。 隆已知多肽分子的基因 在已获得纯净多肽分子的条件下，可采用多肽序列指导引物合成的方法，用 术以靶细胞特异 模板合成相应 者在拥有足量多肽的情况下，制备抗该多肽的抗体，并以此从表达性文库中筛选阳性克隆。其基本原理阐述如下。 肽氨基末端序列指导 物合成法 对高度纯化后的多肽分子作 据氨基酸序列反推出这部分相应的基因序列，并据此指导 的引物合成。同 表达性载体构建的细菌表达性文库。同时，依据 聚腺苷酸) 序列指导合成 聚胸腺苷酸) 的 3端引物。继而，用术从制备细胞的 直接从胞浆内溶物中合成出相应的 据设计引物时引入的酶切位点，将该 隆到可表达性载体中进行产物表达(1992) 。这一方法较适用于难于获得足量多肽、并可用特殊技术得到微量纯品的分子。 肽特异性抗体筛选表达性文库法 该技术路线首先用拥有的多肽分子制备出特异性抗体（多克隆或单克隆抗体）。依据抗原抗体特异结合反应，用标记了示踪物的抗体从相应表达性文库中筛出阳性克隆。早先，这项技术多用 表达性载体构建的细菌表达性文库。将印有细菌裂解碎片的膜浸于含抗体的溶液中孵育, 最后以放射自显影或组织化学得到阳性克隆。这种细菌文库筛选法局限于免疫原性蛋白质的筛选。后来，随着哺乳动